燈盞乙素對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用及機制

季宇彬，馬曉玉，陳榮昌，楊龍坡，孫桂波，孫曉波

(1. 哈爾濱商業大學藥物工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2．中國醫學科學院，北京協和醫學院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100094)

近年來，缺血性心肌病的發病率不斷上升，嚴重威脅著人類的健康。隨著溶栓療法、心外科技術的不斷進步[1]，急性心肌梗死患者的死亡率已逐漸降低，然而，再灌注造成的損傷仍然給患者帶來嚴重的傷害。因此，心肌缺血/再灌注損傷(MIRI)仍然受到廣泛的關注。燈盞乙素(scutellarin，Scu)是從菊科植物燈盞細辛中提取的黃酮類化合物，目前主要用于冠心病、心絞痛、中風、缺血性腦卒中等疾病的治療[2]?，F代藥理研究表明，Scu具有擴張血管、改善微循環、抗缺血損傷等作用[3]，但其對心臟保護的具體作用機制尚不明確。本實驗通過建立大鼠離體心臟心肌缺血/再灌注損傷模型，研究Scu對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用及機制，為其臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠70只，♂，體質量280～350 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥物與試劑Scu標準品，購于上海融禾醫藥科技發展有限公司。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、考馬斯亮藍蛋白檢測試劑盒，均購自南京建成生物醫學工程研究所；白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-18、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、IL-6 ELISA試劑盒，均購于北京海泰通達科技有限公司；一抗β-actin、NF-κB、NLRP3、IL-1β，均購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、ECL化學發光顯色試劑盒、BCA試劑盒、細胞質細胞核蛋白提取試劑盒，均購自康為世紀生物科技有限公司。

1.3 儀器ML870八通道生理記錄儀、PL3508B2-220Langendorff離體心臟灌流系統(埃德儀器國際貿易上海有限公司-PowerLab)；Minipuls 3型蠕動泵(吉爾森)；Infinite M1000酶標儀(瑞士Tecan公司)；電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1離體心臟Langendorff灌流模型的制備 SD大鼠經20%烏拉坦(腹腔注射)麻醉后，舌下靜脈注射肝素鈉(25 mg·kg-1)行肝素化。迅速開胸，并取出心臟(保留足夠長的主動脈)，立即將動脈針套入主動脈并用縫合線扎緊，懸掛于Langendorff灌流裝置上，以恒溫(37.5 ℃)，充二元氧(95% O2+5% CO2混合氣體)，配制K-H，成分如下(g·L-1): NaCl 6.891 2、NaHCO32.09、KCl 0.350 15、KH2PO40.160 6、MgSO4·7H2O 0.290 8、CaCl20.283、葡萄糖1.998，pH 7.4。K-H液以恒流速12 mL·min-1持續逆流灌流15 min。待心臟活動穩定后，通過八通道生理記錄儀記錄心肌收縮功能，包括左室內壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)、室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)、心率(heart rate，HR)。離體心臟以K-H液灌流15 min平衡后，即可進行造模。本實驗采用全心缺血/再灌注損傷模型造模，即全心停灌30 min，再灌45 min，造成心肌缺血/再灌注損傷。

1.4.2Scu對心肌缺血/再灌注損傷的影響 SD大鼠70只，隨機分成5組(n=14)：空白組(Control)、模型組(I/R)、Scu高(HD)、中(MD)、低(LD)劑量組。Scu用生理鹽水配制為0.3、3、30 mg·kg-1，按10 mL·kg-1腹腔注射給藥，給藥組每日給藥1次，連續給藥7 d，空白組和模型組同時給予等量生理鹽水。末次給藥60 min后，分離心臟，置于Langendorff離體灌流裝置上，空白組和模型組用K-H液灌流，Scu低、中、高劑量組用含Scu(0.3、3、30 mg·L-1)的K-H液灌流。在左心耳根部剪一小口，將球囊插入左心室(接ML870數據采集系統)，實時記錄心肌收縮功能：LVSP、±dp/dtmax、HR。各組心臟平衡15 min后，模型組、Scu低、中、高劑量組行缺血/再灌注操作，造成心肌缺血/再灌注損傷?？瞻捉M心臟平衡后，持續灌流45 min。

1.4.3心肌組織HE染色 每組取6顆心臟，剪左心室，用4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，制作切片，脫蠟后行HE染色，光鏡下觀察心肌細胞呈紅色，細胞核呈藍色，每張切片在100倍光學顯微鏡下觀察，并隨機選取5個視野拍照。

1.4.4心肌組織生化指標檢測 每組取8顆心臟，選左心室同一部位組織，按1 ∶9質量體積比加入生理鹽水進行勻漿，4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于生化指標檢測。按照試劑盒說明書，分別測定心肌組織LDH、CK、AST水平，ELISA法測定心肌組織炎性因子TNF-α、ICAM-1、IL-1β、IL-18、IL-6水平。沉淀部分保存于-80 ℃，用于Western blot檢測。

1.4.5Western blot檢測心肌組織蛋白表達 心肌組織勻漿后，3 000 r·min-1離心10 min，取沉淀，加入組織裂解液重懸，于4 ℃裂解1 h ，12 000 r·min-1離心15 min，收集上清液即為總蛋白，細胞核蛋白提取按核蛋白抽提試劑盒操作說明進行。BCA法測定蛋白濃度，每組取20 μg的總蛋白，12% SDS-PAGE分離蛋白，用電轉移法將蛋白質轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，分別加入NLRP3、NF-κB、IL-1β、β-actin、Lamin B一抗，4 ℃過夜；TBST溶液洗滌3次×5 min，加入辣根素過氧化酶標記的二抗，室溫孵育4 h，TBST溶液洗膜3次×5 min，ECL化學發光法顯影。

2 結果

2.1 Scu對離體大鼠心肌收縮功能的影響如Fig 1所示，與空白組比較，再灌注45 min時，模型組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR明顯下降(P<0.05)。與模型組比較，Scu中、高劑量組LVSP、+dp/dtmax、HR明顯升高，Scu低、中、高劑量組-dp/dtmax明顯升高(P<0.05)。表明Scu可以明顯改善缺血/再灌注心肌的收縮功能。

2.2 Scu對離體大鼠心肌組織AST、CK、LDH活性的影響如Tab 1所示，與空白組比較，模型組心肌組織中AST、CK、LDH活性明顯升高(P<0.05)，表明心肌組織發生損傷。與模型組比較，Scu劑量依賴性降低心肌組織LDH、CK、AST活性，其中Scu中、高劑量組差異有顯著性(P<0.05)。表明Scu可以明顯改善離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷。

Tab 1 Effects of Scu on LDH, CK and AST release in myocardial tissue after I/R injury n=8)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R model

2.3 Scu對離體大鼠心肌組織病理結構的影響如Fig 2所示，顯微鏡下觀察心肌組織，空白組心肌纖維排列整齊，橫紋清楚，胞核清晰可見，細胞形態正常，心肌結構基本無異常。模型組心肌排列疏松、紊亂，有多處斷裂，間質增寬伴隨水腫現象，心肌細胞核濃縮，可見多處變性壞死灶，程度較重，心肌纖維間可見大量炎細胞浸潤。與模型組相比，Scu中、高劑量組病變均有不同程度減輕。

2.4 Scu對離體大鼠心肌組織ICAM-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平的影響如Tab 2所示，與空白組比較，模型組大鼠心肌組織ICAM-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，Scu可以劑量依賴性降低心肌組織各炎癥因子水平。其中Scu低、中、高劑量組ICAM-1、TNF-α降低差異具有顯著性(P<0.05)，Scu中、高劑量組IL-18、IL-6、IL-1β降低差異具有顯著性(P<0.05)。表明Scu對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用可能與抑制炎性因子的生成有關。

Fig 1 Effects of Suc on LVSP, +/-dp/dtmax and HR (1 mmHg=0.133 kPa) n=15)

Fig 2 Effect of Scu on isolatedmyocardial ischemia/reperfusioninjury in rats(HE,×200)

Tab 2 Effects of Scu on IL-1β, IL-18, IL-6, TNF-α and ICAM-1 release in myocardial tissue after I/R injury (ng·L-1, n=8)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R model

2.5 Scu對心肌組織IL-1β、NLRP3蛋白表達的影響炎癥小體可以調節炎癥因子的生成與釋放，NLRP3是炎癥小體的重要組成蛋白，因此，本研究通過Western blot檢測心肌組織中NLRP3及下游IL-1β的水平。如Fig 3所示，與空白組比較，模型組IL-1β和NLRP3的蛋白含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，Scu各組明顯降低IL-1β表達水平(P<0.05)，Scu中、高劑量明顯降低心肌組織NLRP3蛋白表達(P<0.05)。表明Scu可能通過抑制NLRP3表達，進而抑制炎癥小體活化及炎性因子的生成。

2.6 Scu對心肌組織NF-κB核轉位的影響NF-κB是體內非常重要的炎性信號通路，Western blot結果顯示(Fig 4)，模型組細胞核內NF-κB水平明顯升高(P<0.05)，而Scu可以劑量依賴性降低NF-κB的核轉位，Scu中、高劑量組差異具有顯著性(P<0.05)。以上研究結果提示，Scu抗炎作用可能是通過抑制NF-κB信號通路來實現的。

Fig 3 Effect of Scu on protein expression of

1:Control；2:I/R；3:I/R+Scu LD；4:I/R+Scu MD；5:I/R+Scu HD.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R model.

3 討論

近年來，缺血性心肌病的發病率不斷上升，嚴重威脅著人類的健康，其中缺血心肌恢復供血引起的MIRI越來越受到人們的關注。隨著藥物溶栓、冠脈搭橋術、瓣膜置換術、心臟移植等治療技術手段的提高和廣泛應用，探索防治MIRI的藥物已成為重要研究方向[4-5]。

Fig 4 Effect of Scu on protein expression of NF-кB in myocardial tissues n=8)

1:Control；2:I/R；3:I/R+Scu LD；4:I/R+Scu MD；5:I/R+Scu HD.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R model.

LVSP、±dp/dtmax、HR是反映心功能的重要指標。LVSP是左心室收縮時產生的強大內在壓力，其值反映左室的功能狀態?！纃p/dtmax是左室內壓最大下降速率和左室內壓最大上升速率，其值反映心肌舒張功能。本研究顯示，Scu可明顯提高LVSP、±dp/dtmax、HR，改善左心室收縮與舒張功能。LDH、CK、AST是心肌損傷的標志物，當心肌組織發生病變時，LDH、CK、AST的含量明顯升高。研究顯示，Scu可明顯下調缺血/再灌注心肌組織中LDH、CK、AST的含量。結合心肌組織病理觀察，表明Scu可以減輕缺血/再灌注心肌組織的損傷，改善心肌收縮功能。

炎癥反應在MIRI過程中起到非常重要的作用。心肌缺血初期及再灌注過程中，均會激發心肌細胞內源性的炎癥反應，誘導大量促炎因子的生成及釋放。炎性因子不僅引起心肌電生理重構和心律失常，還直接改變心肌細胞的生理狀態，誘發氧自由基的生成、細胞膜功能障礙和損傷，引起鈣超載，使心肌細胞嚴重受損，大量細胞凋亡、壞死、纖維化，進而導致心力衰竭而危及生命，抑制心肌炎癥反應對治療MIRI具有非常重要的意義[6]。多種炎性因子參與了MIRI，其中IL-1β是調節炎癥反應的關鍵因子，其參與了免疫細胞的募集，為其他促炎因子后續生成提供必要條件?；贗L-1β在炎癥反應中的重要作用，調控其生成可以明顯減輕MIRI。結果顯示，缺血/再灌注心肌組織炎癥因子水平明顯增加，而Scu能明顯下調缺血/再灌注心肌組織炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18、ICAM-1的水平。表明Scu對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用可能與抑制炎性因子的生成有關。

NLRP3炎癥小體的激活與MIRI的發生關系密切[7-8]。研究發現，炎癥小體NLRP3能夠通過激活炎性caspase-1蛋白激酶，誘導IL-1β的生成。缺血/再灌注心肌組織中，NLRP3及ASC蛋白表達水平明顯增加。炎癥小體的激活及IL-1β釋放最終導致細胞炎癥反應瀑布式發生，進而導致更多的內源性危險信號的生成及炎癥信號的放大，引起中性粒細胞及單核細胞的黏附及自由基的生成，誘發細胞水腫、死亡，并損傷心肌成纖維細胞等[9]。炎癥小體及其下游炎性信號分子的激活是誘發心肌缺血后炎癥反應的重要途徑。抑制NLRP3炎癥小體的激活，對于減輕MIRI意義重大。本研究顯示，Scu可以明顯降低心肌組織NLRP3蛋白表達水平。

NF-κB信號通路廣泛存在于真核細胞中，靜息狀態下，NF-κB以一種無活性的形式在胞質中，與抑制性蛋白IκB相結合；在刺激因素作用下，IκB磷酸化并降解，NF-κB由胞質轉移到胞核，可促進下游炎癥基因轉錄的發生[10-11]，參與炎癥反應、細胞增殖、分化、凋亡等[12]。有研究表明，抑制NF-κB可下調NLRP3炎性小體的激活，進而減少IL-1β的分泌[1]。由于NF-κB是轉移到細胞核內發揮生理作用，因此，本研究通過Western blot檢測了其在細胞核內的表達情況。研究結果顯示，相比于模型組，Scu可明顯降低NF-κB核轉位。

綜上，本研究證實Scu可明顯減輕再灌注過程中心肌組織的炎癥反應和損傷，提高心肌收縮功能，其作用機制可能與抑制NF-κB /NLRP3/IL-1β通路，進而抑制炎癥因子的生成有關。

(致謝：本實驗于中國醫學科學院藥用植物研究所藥理毒理中心實驗室完成，感謝所有參與實驗的老師及同學！)