丹蛭降糖膠囊對糖尿病腎病大鼠TGF-β1/Smads信號通路的調控作用

賈會玉，段陳方圓，李 莉，呂 磊，李中南，陳光亮

(1. 安徽中醫藥大學中西醫結合學院，安徽省中藥復方研究重點實驗室,安徽 合肥 230012；2. 安徽省醫學科學研究院藥理毒理研究所，安徽 合肥 230061)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最為易發的并發癥之一，發病率為20%～40%，病程中伴隨著復雜病理變化，細胞肥大、細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的聚集引起腎小球基底膜與腎小管基底膜增厚，導致腎臟細胞的炎性和纖維化，進而導致腎臟組織整體的纖維化, 最終發展為終末期腎病，已成為糖尿病患者死亡的主要原因[1]。轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)在慢性腎病中起著重要作用，并作為重要生物學標志物和主要治療靶標逐漸被臨床認可[2]。TGF-β1/Smads信號通路作為TGF-β1介導的重要信號通路，參與了DN眾多進程，足細胞損傷、基底膜增厚、系膜細胞增生、腎細胞凋亡、上皮細胞間質轉化等都有TGF-β1/Smads參與。除此之外，ECM中許多成分可以被TGF-β1/Smads信號通路刺激，進而發生ECM進行性積聚，最終導致腎臟組織纖維化[3]。

丹蛭降糖膠囊(Danzhijiangtang capsule，DZJT)是根據安徽中醫藥大學第一附屬醫院國家中醫臨床研究基地重點病種——糖尿病研究的經驗方研制而成的院內制劑(皖藥制字Z20090006)，獲得國家發明專利(專利號ZL200310112845.1)，由太子參、地黃、丹皮、澤瀉、菟絲子、水蛭等六味中藥制成，具有益氣、養陰、活血之功效，主治2型糖尿病及其慢性并發癥之氣虛陰虧血瘀癥。前期研究表明，DZJT對糖尿病大鼠腎病有明顯的防治作用[4]，本研究觀察DZJT對糖尿病大鼠腎臟TGF-β1/Smads信號通路的調控作用，并以此探討DZJT對DN的防治作用和可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 清潔級3月齡健康♂SD大鼠，體質量(200±20)g，購自安徽省醫學實驗動物中心，合格證號：Scxk(皖)2013-002。大鼠分籠喂養，自由飲食，保持良好的通風環境，溫度及濕度保持在適宜狀態。

1.1.2藥物 丹蛭降糖膠囊，安徽中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心所制，太子參、地黃、牡丹皮、澤瀉、菟絲子、水蛭六味中藥重量比為5 ∶4 ∶4 ∶3 ∶2 ∶5，干燥水蛭研細粉過100-120目篩滅菌備用，其余五味中藥加水煎煮2～3次，每次1～2 h，合并煎液，濾過，濃縮，噴霧制粒，加入水蛭粉，混勻，裝入膠囊，批號20131216；鹽酸吡格列酮片，杭州中美華東制藥有限公司，批號20130827。

1.1.3試劑與儀器 鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)(Sigma公司，批號：20130805427)；尿素氮試劑盒(批號：0214041)、血肌酐試劑盒(批號：1114071)、尿蛋白檢測試劑盒(批號：1114031)，均購自四川Maccura生物科技股份有限公司；尿微量白蛋白放射免疫試劑盒(濰坊市三維診斷技術有限公司，批號：20140605)；TGF-β1、Smad3、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)抗體(美國Abcam公司)；Smad2、Smad7抗體(美國Santa Cruz公司)；β-actin抗體(Bioworld公司)。BX51型顯微鏡(日本Olympus公司)；3K15型離心機(美國Sigma公司)；FCM凝膠成像儀(美國Protein Simple 公司)。

1.2 方法

1.2.1模型的制備 大鼠適應性喂養1周，100只SD♂大鼠中隨機選取12只作為正常組，普通飼料喂養；其余大鼠給予高脂飼料(蛋白質14%、脂肪35%、碳水化合物51%)喂養，4周后，禁食12 h，參照本課題組的方法造模[5]，以空腹血糖≥7.0 mmol·L-1并剔除血糖過高者(血糖測定儀顯示為high)為糖尿病成模標準。

1.2.2分組與給藥 成模大鼠65只，隨機分為模型組、DZJT高、中、低劑量組(1 080、540、270 mg·kg-1)、吡格列酮(10 mg·kg-1)組，每天1次灌胃給藥，連續給藥8周，正常組與模型組給予等量溶媒。給藥期間，由于打斗、灌胃等原因，大鼠死亡5只，其中模型組2只，DZJT高、中、低劑量組各1只。

1.2.3血糖檢測 給藥前及給藥后第4周、8周，大鼠剪尾取血，測定隨機血糖。末次給藥后，腹主動脈取血，測定HbAlc。

1.2.4腎功能檢測 末次給藥后，收集大鼠24 h尿液，測定尿微量白蛋白(mAlb)、尿蛋白。取血測定血清血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen， BUN)、TGF-β1。

1.2.5病理學檢查 取腎組織包埋切片，HE染色。200倍顯微鏡下，隨機10個不重疊視野，根據發生病變腎小管(如腎小管的擴張或萎縮、間質擴張、炎細胞浸潤或水腫等)所占總腎小管的比例進行評分：未發生病變為0分，<25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分，>75%為4分[4]。

1.2.6TGF-β1/Smads信號通路蛋白檢測 采用Western blot法和免疫組織化學法對TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、CTGF蛋白進行測定。免疫組化法：制片后200倍顯微鏡下觀察，每組隨機觀察6個不重疊視野，采用Image-Pro Plus Version 6.0圖像分析系統對圖片進行半定量分析，各視野下陽性目標光密度和陽性面積百分比，即平均光密度(average optical density，AOD)代表蛋白的表達量。Western blot法：凝膠成像儀中曝光，采用Image-Pro Plus Version 6.0圖像分析系統吸光度分析，以所測得的各指標的吸光度與內參照β-actin吸光度的比值代表定量值。

2 結果

2.1 DZJT對大鼠血糖的影響Tab 1結果顯示，模型組大鼠血糖(blood glucose，BG)、HbA1c明顯高于正常組；給藥第4周、8周，吡格列酮組、DZJT高、中、低劑量組大鼠BG、HbA1c明顯下降(P<0.01，P<0.05)。

2.2 DZJT對大鼠腎功能的影響Tab 2結果顯示，與正常組相比，給藥8周后，模型組尿蛋白量、BUN、Scr、mAlb、TGF-β1水平明顯升高(P<0.01)；各給藥組相較于模型組，尿蛋白量、BUN、Scr、mAlb、TGF-β1水平明顯改善(P<0.01，P<0.05)。

2.3 DZJT對大鼠腎臟病理學的影響如Fig 1所示，正常組大鼠未見腎損傷，其腎小球、腎小管結構完整，鮑曼氏囊結構完整，外緣清晰，未見炎性細胞浸潤。模型組大鼠腎小球體積增大，細胞數增多，系膜區增寬，系膜細胞和系膜基質增多，腎小管上皮細胞出現壞死脫落、水腫、空泡變性，小管腔中有透明管型，病理評分明顯上升(P<0.01)。與模型組相比，各給藥組損傷均出現不同程度改善，病理評分值明顯下降(P<0.05，P<0.01)。

Tab 1 Effect of Danzhijiangtang capsule on BG, HbAlc in

**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Tab 2 Effect of Danzhijiangtang capsule on renal function in

**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Fig1EffectofDanzhijiangtangcapsuleonpathology
inrenaltissuesofrats(HE, ×200)

2.4 DZJT對大鼠腎組織TGF-β1/Smads信號通路蛋白的影響

2.4.1免疫組化法 Tab 3、Fig 2結果表明，TGF-β1、Smad3、Smad2及Smad7在腎組織細胞胞質中表達，呈棕黃色塊狀或顆粒，CTGF在腎組織細胞核內表達，呈粒狀。與正常組相比，模型組大鼠TGF-β1、Smad3、CTGF表達呈強陽性(P<0.01)，而Smad2、Smad7表達減弱(P<0.01)；與模型組相比，各給藥組TGF-β1、Smad3、CTGF蛋白表達明顯下降(P<0.01)，Smad2、Smad7表達明顯增加(P<0.01,P<0.05)。

2.4.2Western blot法 由Fig 3可見，TGF-β1、Smad3、CTGF蛋白在模型組中表達明顯高于正常組(P<0.01)，Smad2、Smad7蛋白則與之相反(P<0.01)。各給藥組TGF-β1、Smad3、CTGF蛋白表達相較于模型組則出現不同程度降低(P<0.01)，Smad2、Smad7蛋白相較于模型組出現不同程度升高(P<0.01)。

Tab 3 Effect of Danzhijiangtang capsule on TGF-β1/Smads signaling pathway in renal tissues of

**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3 討論

本實驗采用造模方法為課題組多次實驗摸索[4]，以空腹血糖≥7.0 mmol·L-1并剔除血糖過高者(血糖測定儀顯示為high)為成模標準，避免大鼠進食時間不統一造成的隨機血糖值不穩定，無法真實反映其血糖水平的情況，并通過剔除過高血糖大鼠，避免胰島過度損傷造成的大鼠實驗中死亡。高脂喂養4周聯合多次小劑量STZ(34 mg·kg-1)腹腔注射，既有較高的成模率，又避免了一次性大劑量STZ注射造成的高死亡率[6]。造模后，大鼠BG、HbAlc明顯升高，且模型組在8周內一直維持較高水平，說明實驗所用模型成功且穩定。治療8周后，給藥組大鼠較模型組大鼠BG、HbAlc明顯降低，顯示DZJT能有效改善模型大鼠的糖代謝。給藥8周后，各給藥組大鼠腎功能指標明顯改善，腎臟病理也出現不同的改善，病理評分明顯上升，顯示DZJT能有效地改善STZ對大鼠造成的腎損傷。

TGF-β1在DN病程發展中參與多個環節，可調控多個影響DN病程的信號通路，在腎臟纖維化發展的進程中處于關鍵位置,可指示慢性腎病病程，為主要治療靶標[2]。無論是體內還是體外實驗均顯示，DN早期TGF-β1 mRNA及TGF-β1表達已有明顯升高[7]，而下調TGF-β1水平對四氧嘧啶或STZ誘導的DN模型均表現出一定的腎保護作用[8]。與文獻報道相符，本次實驗中，給藥8周后模型組TGF-β1蛋白無論是在血清中，還是在腎組織中均明顯升高，給藥組較模型組則出現不同程度下降。

Fig 3 Western blot expression of TGF-β1/Smadssignaling pathway in renal tissues of

1:Normal group; 2: Model group; 3: DZJT 1 080 mg·kg-1group; 4: DZJT 540 mg·kg-1group; 5: DZJT 270 mg·kg-1group; 6: Pioglitazone group.**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsmodel.

TGF-β1/Smads信號通路作為TGF-β1介導的重要信號通路，在腎臟纖維化中發揮著重要作用。當TGF-β1與其Ⅰ、Ⅱ型受體相結合形成三聚體后，會被下游Smad2和Smad3蛋白所識別[9]，再將信號傳遞給Smad4，從而上調核內CTGF蛋白的表達，并刺激Smad7啟動子轉錄增加[10]。單側輸尿管閉塞誘導的腎纖維化小鼠模型中，分別采用免疫組織化學法、Western blot法檢測Smad3蛋白表達水平，均顯示升高[11]。Smad3調節著腎臟纖維化，在體外，多種致纖維化因子均可以激活Smad3，基因敲除Smad3可以抑制小鼠和細胞纖維化[12]。本實驗結果發現，模型組大鼠Smad3水平明顯升高，給藥8周后,各給藥組Smad3水平較模型組均有不同程度降低。CTGF作為TGF-β1/Smads信號通路下游蛋白，被認為可能是最終導致組織器官纖維化的關鍵因子，CTGF可介導細胞遷移、侵襲、血管發生和細胞凋亡的發生，并促進膠原及纖維連接蛋白等ECM的產生和沉積[13]。本實驗中，兩種檢測手段均顯示模型組CTGF表達明顯升高，給藥8周后,各給藥組CTGF水平較模型組均有不同程度降低，DZJT對腎臟的保護作用可能與其調節CTGF水平有關。Smad7蛋白啟動子轉錄增加，表達上調，會競爭性地與TβR-Ⅰ結合，反饋性抑制Smad3磷酸化，并通過誘導NF-κB抑制劑α的表達，抑制NF-κB驅動的炎癥反應[14]。本實驗STZ誘導模型大鼠腎臟組織中，Smad7蛋白表達明顯低于正常組，給藥8周后,各給藥組Smad7水平較模型組均有不同程度升高，與文獻報道一致。Smad2調控腎纖維化作用存在爭議，文獻報道，并非是Smad2調節著腎臟纖維化。雖然在體外多種致纖維化因子均可以激活Smad2，但基因敲除Smad2并未能有效抑制小鼠或細胞纖維化[15]。但亦有學者認為，腎臟損傷伴隨著磷酸化Smad2表達的升高，磷酸化Smad2是腎臟損傷的指標性蛋白。本實驗中，模型大鼠腎臟組織中Smad2蛋白表達明顯低于正常組，給藥8周后,各給藥組Smad2水平較模型組均有不同程度升高。Smad2在腎臟纖維化、腎臟損傷中究竟扮演著什么樣的角色，還不能下結論，在以后的工作中，我們會繼續對其研究。但不論Smad2起著什么樣的作用，TGF-β1/Smads信號通路在腎臟纖維化中起著十分重要的作用是毋庸置疑的，DZJT對腎臟體現出的良好保護作用，其機制可能與影響TGF-β1/Smads信號通路及其下游CTGF表達有關。

(致謝：本研究在安徽中醫藥大學中西醫結合臨床學院藥理學實驗室完成，衷心感謝本課題組所有老師和同學的指導和幫助。)