去氫駱駝蓬堿通過PTEN/Akt/MDM2信號通路抑制胃癌細胞COX-2表達

陶婷婷，蔣世燁，孫夢雪，張文靈，余 納，劉高雙，李曉林，邵 耘，孫為豪

(南京醫科大學第一附屬醫院老年消化科，江蘇 南京 210029)

在全球癌癥死亡率中胃癌排名第2，且絕大多數病例被確診時已為晚期階段，低于20%的患者經過各種綜合治療后可生存5年以上。目前，治療惡性腫瘤的主要手段是根治性手術及術后輔助化療。然而，在應用傳統化療藥物抑制或殺傷腫瘤細胞期間，大部分患者會出現嚴重的毒副反應，如感染、納差、器官毒性作用等。因此，尋找療效強且毒副反應輕的新型化療藥對腫瘤治療意義重大。去氫駱駝蓬堿(harmine，HM)來源于蒺藜科植物駱駝蓬的種子，是其主要活性成分，具有殺菌抗炎、抑制腫瘤細胞生長增殖、抗白血病等藥理作用[1]。已有學者研究發現，HM抑制胃癌細胞增殖、遷移及侵襲的作用機制主要與下調環氧合酶2(cyclooxygenase 2， COX-2)的蛋白表達水平相關[2]，然而，HM抑制COX-2表達的信號轉導通路目前尚不明確。

PTEN是一種抑癌基因，可通過下調磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3 kinase，PI3K)/Akt信號通路，來抑制腫瘤細胞的生長，并使細胞周期停滯[3-4]。Akt可通過其活化形式磷酸化Akt(p-Akt)激活通路下游的信號分子，是細胞信號轉導系統及細胞周期調控系統的一種重要激酶。小鼠雙微體基因2(murine double minute 2，MDM2)是高度擴增的細胞癌基因，p53基因是腫瘤抑制基因，兩者構成的體系與細胞惡性轉化而發生癌變密切相關，尤其是消化系統腫瘤[5-7]。本研究以COX-2呈現高表達的SGC-7901和MKN-45胃癌細胞株為實驗對象，通過轉染siRNA分別敲減PTEN、Akt、MDM2基因后，觀察HM對胃癌細胞COX-2表達的影響，進一步明確PTEN/Akt/MDM2通路在HM抑制胃癌細胞COX-2表達中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株人胃腺癌細胞株SGC-7901(中分化)，購自中國科學院上海生科院細胞資源中心；人胃腺癌細胞株MKN-45(低分化)，購自南京凱基生物公司。

1.2 試劑HM(Sigma公司)；抗Akt、p-Akt、MDM2、p-MDM2、COX-2、PTEN抗體(Abcam公司)；PTEN-siRNA、Akt-siRNA、MDM2-siRNA以及陰性對照NC-siRNA(上海吉瑪公司)；LipofectamineTM2000轉染試劑(Invitrogen公司)；ECL發光試劑盒、BCA試劑盒(Pierce公司)。

1.3 儀器細胞培養箱 (Thermo公司)；蛋白免疫印跡系統(Bio-Rad公司)；熒光/化學發光成像系統(Tanon公司)。

1.4 細胞培養用RPMI 1640培養基(含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)培養細胞，置于培養箱中(37 ℃、5% CO2)，2 d換液1次，3 d傳代1次。

1.5 細胞轉染將細胞分為空白對照組(無轉染)、陰性對照組(轉染NC-siRNA)、轉染組(轉染PTEN-siRNA或Akt-siRNA或MDM2-siRNA)。將生長狀態活躍的細胞接種于6孔板，并用培養基(不含雙抗)培養至細胞密度達30%～50%后，進行瞬時轉染。先混勻RPMI 1640(250 μL)和siRNA(100 nmol·L-1)，再取LipofectamineTM2000(5 μL)加入RPMI 1640(250 μL)中，放置5 min，將兩者混勻靜置20 min后，加入6孔板，每孔加入培養基(無雙抗)1.5 mL，轉染后6 h換液，繼續培養24 h后，用于進一步實驗。

1.6 蛋白提取和蛋白質印跡在轉染24 h后的6孔板中加入或不加20 μmol·L-1HM處理，24 h后收集各組細胞，PBS洗滌3次后，加入細胞裂解液提取總蛋白，并測定蛋白含量。上樣、電泳、轉膜后，4 ℃封閉2 h，經過3次洗膜后，加入一抗4 ℃孵育過夜，洗膜3次后，二抗4 ℃孵育2 h，洗膜3次后，加入發光液，對目的蛋白進行半定量分析。

2 結果

2.1 敲減PTEN基因對胃癌細胞PTEN、p-Akt、p-MDM2及COX-2表達的影響Fig 1的Western blot結果顯示,在PTEN-siRNA轉染組中PTEN蛋白表達量與空白對照組及陰性對照組相比明顯降低，而p-Akt、p-MDM2和COX-2蛋白表達量則明顯增加。

2.2 敲減Akt基因對胃癌細胞p-Akt、p-MDM2及COX-2表達的影響Fig 2的Western blot結果顯示，在Akt-siRNA轉染組中，p-Akt、p-MDM2和COX-2蛋白表達量均明顯低于空白對照組及陰性對照組。

2.3 敲減MDM2基因對胃癌細胞p-MDM2和COX-2表達的影響Fig 3的Western blot結果顯示，在MDM2-siRNA轉染組中，p-MDM2和COX-2蛋白的表達量均明顯低于空白對照組及陰性對照組。

2.4 PTEN在HM抑制胃癌細胞p-Akt、p-MDM2和COX-2表達中的作用Fig 4的Western blot結果顯示，在HM組中PTEN蛋白表達量明顯高于陰性對照組，p-Akt、p-MDM2、COX-2蛋白表達量則明顯降低。加入HM并敲減PTEN基因組p-Akt、p-MDM2、COX-2蛋白的表達量明顯高于單純加入HM組；敲減PTEN基因可逆轉HM抑制胃癌細胞Akt和MDM2磷酸化及COX-2蛋白表達的作用。

Fig 1 Effects of PTEN-siRNA on PTEN,Akt and MDM2 phosphorylation,and COX-2 expression in SGC-7901(A) and MKN-45(B) *P<0.05,**P<0.01 vs control

Fig 2 Effects of Akt-siRNA on Akt and MDM2 phosphorylation and COX-2 expression in SGC-7901(A) and MKN-45(B) **P<0.01 vs control

Fig 3 Effects of MDM2-siRNA on p-MDM2 and COX-2 expression in SGC-7901(A) and MKN-45(B)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.5 Akt在HM抑制胃癌細胞p-MDM2和COX-2表達中的作用Fig 5的Western blot結果顯示，在HM組中p-Akt、p-MDM2、COX-2蛋白表達量均明顯低于陰性對照組；加入HM并敲減Akt基因組p-Akt、p-MDM2、COX-2蛋白表達明顯低于單純加入HM組；敲減Akt基因可協同HM抑制MDM2磷酸化和COX-2蛋白表達。

2.6 MDM2在HM抑制胃癌細胞COX-2表達中的作用Fig 6的Western blot結果顯示，HM組p-MDM2、COX-2蛋白表達量明顯低于陰性對照組；加入HM并敲減MDM2組p-MDM2、COX-2蛋白表達量明顯低于單純加入HM組；敲減MDM2基因可協同HM抑制COX-2蛋白表達。

Fig 4 Effects of PTEN-siRNA on HM-mediated PTEN,Akt and MDM2 phosphorylation,

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsHM treatment group;△P<0.05,△△P<0.01vsPTEN-siRNA without HM treatment group

Fig 5 Effects of Akt-siRNA on HM-inhibited Akt and MDM2 phosphorylation,and COX-2 expression

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsHM treatment group;△△P<0.01vsAkt-siRNA without HM treatment group

Fig 6 Effects of MDM2-siRNA on HM-induced p-MDM2 and COX-2 expression in SGC-7901(A) and MKN-45(B) )

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsHM treatment group;△△P<0.01vsMDM2-siRNA without HM treatment group

3 討論

COX-2是機體受到外傷或感染等刺激后，由免疫細胞迅速產生的誘導酶，可促進花生四烯酸轉變為重要的生物激素——前列腺素，從而促進炎性反應，使組織受損。前期研究表明，COX-2的異常表達將導致胃癌的發生發展[8-9]，特異性COX-2抑制劑可有效抑制胃癌細胞增殖遷移，抑制腫瘤形成[10]。HM在體外可通過下調胃癌細胞COX-2蛋白水平，來降低細胞侵襲力，阻礙腫瘤形成[2]。然而，進一步明確HM抑制COX-2表達的作用機制，是目前亟待解決的問題。

PTEN作為一種具有雙重活性的抑癌基因，對細胞生長周期的調控具有關鍵性作用，并可通過阻斷持續活化的PI3K/Akt通路來促進腫瘤細胞凋亡[3-4]。本研究結果顯示，HM可促進SGC-7901及MKN-45胃癌細胞株PTEN表達增加，下調p-Akt、p-MDM2和COX-2的表達。MDM2是一種在一系列人類癌癥中過表達的腫瘤蛋白，既往研究結果表明[11]，p-Akt可激活MDM2，使其進入細胞核并泛素化p53，p53的失活使得受損DNA的異常細胞繼續分裂復制，最終導致組織惡變。PTEN則可下調Akt依賴的MDM2磷酸化，促進p53表達，MDM2與p53構成降解-反式激活循環通路，以維持正常細胞功能，消除突變細胞[12]。若MDM2或p53有任何一方基因突變、異常表達等，都可能導致該調節機制的平衡穩定狀態被破壞，最終將可能直接導致細胞惡變，腫瘤形成[13]。因此，MDM2是促進惡性腫瘤形成的一個重要因素。本研究結果顯示，PTEN基因敲減可逆轉HM抑制p-Akt、p-MDM2和COX-2蛋白表達的作用，提示HM可能通過上調PTEN表達來抑制p-Akt、p-MDM2和COX-2過表達誘導的胃癌細胞增殖。Akt基因敲減具有協同HM下調p-MDM2和COX-2蛋白表達的作用，提示HM可能通過下調p-Akt表達，來抑制p-MDM2和COX-2過表達誘導的胃癌細胞增殖。MDM2基因敲減可協同HM下調COX-2蛋白表達水平，提示HM可能通過下調p-MDM2表達，來抑制COX-2過表達誘導的胃癌細胞增殖。Kuo等[14]提出，小檗堿可調控PI3K/Akt通路來抑制癌細胞生長代謝，促其凋亡。Dung等[15]研究發現，地奧司明通過p53活化和PI3K-Akt-MDM2信號轉導途徑及誘導G2/M期細胞周期停滯，來降低HA22T肝癌細胞活力、抑制細胞增殖。由此可推測得出，PTEN/Akt/MDM2可能是HM誘導COX-2表達下調的信號通路，并由此阻礙胃癌細胞增殖。但HM也可能通過其他通路，甚至其他層面來抑制胃癌細胞生長增殖，且目前僅進行了細胞層面的體外實驗研究，要系統全面地了解其確切機制仍需進一步研究。

(致謝：本實驗在南京醫科大學第一附屬醫院老年醫學實驗室完成，在此對以上實驗室和實驗過程中給予指導和幫助的老師表示感謝！)