黑根霉胞外多糖聯合奧沙利鉑對二甲肼誘導的大鼠結腸癌的抑制作用及對Survivin/caspase-3/caspase-7的影響

王顏天池，鹿 艷，韓 軍，王國棟，袁平川，柳春燕，陳靠山

(1. 安徽省多糖藥物工程技術研究中心，活性生物大分子研究安徽省重點實驗室，皖南醫學院藥物研發中心，皖南醫學院藥學院，安徽 蕪湖 241002；2. 山東大學生命科學學院，山東 青島 266000)

結腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一[1]。奧沙利鉑(oxaliplatin)屬于新型鉑類抗癌藥物，是目前臨床治療結腸癌的常用化療藥物[2]。研究表明，奧沙利鉑抗腫瘤作用與其抑制生存素(Survivin)的表達有關[3]。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的成員之一[4]。Survivin可通過抑制caspase-3和caspase-7的活性，抑制腫瘤細胞的凋亡進程[5]，是腫瘤發生和發展的重要誘因。

真菌多糖具有抗腫瘤的生物活性，其中香菇多糖、云芝多糖、茯苓多糖等真菌多糖已應用于臨床腫瘤治療中[6]。黑根霉胞外多糖(exopolysaccharide fromRhizopusnigricans，EPS)是本課題組從黑根霉真菌發酵液中提取并分離純化得到的一種活性多糖，分子質量為9 682 u，由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖以摩爾比5.89 ∶3.64 ∶3.2 ∶1組成。前期研究發現，EPS可誘導人結腸癌HTC-116細胞凋亡[7]，并能明顯抑制CT26荷瘤小鼠腫瘤的生長[8]。但EPS和奧沙利鉑聯合使用對腫瘤的抑制是否具有協同作用，尚不清楚。本研究以1，2-二甲肼(1，2-dimethylhydrazine，DMH)皮下注射建立大鼠結腸癌模型，研究EPS和奧沙利鉑聯用對結腸癌大鼠的作用，并進一步探討EPS和奧沙利鉑對結腸癌大鼠Survivin、caspase-3和caspase-7蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物40只♂Wistar大鼠，體質量80～100 g，由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供，動物合格證號：SCXK(滬)2013-0006。實驗過程中，所有大鼠均自由進食和飲水。

1.2 藥物與試劑DMH和奧沙利鉑(美國Sigma公司)；caspase-3、caspase-7、Survivin兔單克隆抗體(美國CST公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蘇木精-伊紅(HE)染色相關試劑(上海碧云天生物技術有限公司)；無水乙醇、二甲苯、中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 方法

1.3.1EPS的提取 將黑根霉孢子接種于馬鈴薯瓊脂蔗糖(PDA)固體培養基中活化后，轉接至馬鈴薯蔗糖(PDB)液體培養基中，在28 ℃、120 r·min-1條件下連續培養10 d。將發酵液過濾后，收集過濾液，并加入其3倍體積的95%乙醇靜置過夜。收集沉淀，并用蒸餾水充分溶解，經大孔樹脂脫色，Sevage法脫蛋白后，冷凍干燥得到黑根霉胞外粗多糖。之后經DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱層析，SephadexG-100凝膠柱層析分離純化后，得到EPS。

1.3.2DMH誘導大鼠結腸癌模型的建立 將40只Wistar大鼠，經過1周的適應性喂養，隨機分為5組，每組8只。A：空白對照組；B：模型對照組；C：EPS治療組；D：奧沙利鉑治療組；E：EPS+奧沙利鉑治療組。B～E組大鼠均由頸背部皮下注射DMH(30 mg·kg-1)，每周注射1次，連續15周，建立大鼠結腸癌模型[9]。空白對照組皮下注射相同劑量的生理鹽水。C組從第2周開始灌胃EPS(150 mg·kg-1)，每天1次，到20周。D組從16周造模結束，開始將奧沙利鉑(10 mg·kg-1)溶解于5%的葡萄糖溶液，腹腔注射給藥，每周1次，共4次。E組給藥過程同C、D組。A、B組給予灌胃、腹腔注射相同劑量的生理鹽水和5%的葡萄糖溶液。

1.3.3實驗動物的處理 實驗第21周，禁食不禁水12 h后。腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉大鼠，腹主動脈取血，之后再取結腸組織。保存于-80 ℃冰箱。

1.4 檢測指標和方法

1.4.1HE染色 將剛取出的新鮮結腸組織用4%多聚甲醛固定后，常規石蠟包埋切片，將石蠟切片依次置于蘇木精染液染色，再放入伊紅染液中染色。脫水、透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察分析結腸組織的病理學變化。

1.4.2Western blot法檢測結腸組織中Survivin、caspase-3、caspase-7的蛋白表達 取100 mg結腸組織，加800 μL RIPA裂解液，在冰上充分勻漿裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min后取上清，BCA試劑盒檢測蛋白含量；上樣，SDS-PAGE電泳后，轉印至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h后，加入一抗Survivin、caspase-3和caspase-7(1 ∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜，加入對應的二抗，室溫搖床孵育1 h，加入ECL發光劑曝光，顯影、定影；結果用Image-Pro Plus軟件統計分析每個條帶灰度值。

1.4.3免疫組化檢測結腸組織中Survivin、caspase-3、caspase-7的蛋白表達 將結腸組織石蠟切片依次進行抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶和血清封閉。加入一抗Survivin(1 ∶200)、caspase-3(1 ∶100)、caspase-7(1 ∶100)濕盒內4 ℃孵育過夜，加入對應的二抗，室溫孵育1 h。DAB顯色和蘇木精復染后，依次脫水，透明，中性樹膠封片。顯微鏡采集圖像，應用Image-Pro Plus對圖像進行分析。其中蘇木精將細胞核染為藍色，DAB顯示的陽性表達為黃色至棕褐色。

2 結果

2.1 各組大鼠結腸組織病理學觀察如Fig 1所示，正常對照組可見結腸組織腺體排列整齊，無炎癥細胞浸潤，并含有大量杯狀細胞(圖中紅色箭頭所示的空泡狀結構)。模型組可見結腸腺體排列紊亂，炎癥細胞浸潤嚴重，杯狀細胞幾乎消失，細胞層次增多且擁擠。EPS組和奧沙利鉑組結腸腺體形態大小不規則，可見少量杯狀細胞，炎癥細胞浸潤的程度降低。尤其是聯合用藥組，結腸結構明顯較模型組更加完整。表明EPS可以改善結腸組織的損傷程度，同時聯合奧沙利鉑給藥的效果更佳。

Fig 1 Pathological changes incolon tissues of rats(HE×400)

A:Control group;B:Model group;C:EPS group;D:Oxaliplatin group;E:EPS+oxaliplatin group.

2.2 EPS聯合奧沙利鉑對結腸組織中Survivin、caspase-3和caspase-7表達的影響由Fig 2可知，Survivin蛋白在模型組中的表達升高，而治療組的表達明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，治療組中caspase-3和caspase-7的蛋白表達明顯升高，且EPS和奧沙利鉑聯合給藥組的蛋白表達最高(P<0.05)。實驗結果表明，EPS和奧沙利鉑可能通過抑制Survivin蛋白的表達，促進caspase-3和caspase-7蛋白的表達，從而抑制結腸癌的發生和發展，且聯合用藥的效果更明顯。

同時，通過免疫組化的方法檢測大鼠結腸組織中Survivin、caspase-3和caspase-7蛋白的陽性表達。由Fig 3可知，治療組與模型組相比，Survivin蛋白的陽性表達明顯降低，而caspase-3、caspase-7蛋白的陽性表達明顯升高(P<0.01)。結果與Western blot結果一致。

3 討論

結腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤，并且發病率趨于年輕化[10]。奧沙利鉑是第3代鉑類抗癌藥物，具有高效、不易耐藥等特點，具有良好的抗腫瘤活性[11]。但由于奧沙利鉑對血液、周圍神經系統的毒性，嚴重影響患者的生活質量，限制了其在結腸癌治療中的長期使用。所以，尋找有效且毒副作用低的輔助治療癌癥藥物尤為重要。

真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體及發酵液中分離得到的一種活性物質。近年來，其抗腫瘤作用成為學者們研究的重要方向。本課題組前期研究發現，EPS體外可明顯抑制人結腸癌HTC-116細胞的增殖，對S180實體瘤和CT26結腸癌移植瘤小鼠有明顯的抑制作用[7-8,12]。但EPS的作用機制還需要進一步研究。

本實驗通過DMH誘導建立大鼠結腸癌模型，并同時給予EPS、奧沙利鉑單用以及聯合給藥治療，通過病理切片觀察，可見EPS能明顯改善結腸組織的損傷程度，同時聯合給藥具有協同抑制作用。為了進一步探討EPS和奧沙利鉑抑制大鼠結腸癌的作用機制,本研究檢測了細胞凋亡相關蛋白Sur-vivin、capsase-3和caspase-7的表達。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，是目前發現的最強大的凋亡抑制因子。研究表明，Survivin在結腸癌、肺癌、乳腺癌、喉癌、子宮癌、胃癌以及血液系統癌癥中均有明顯高表達。因此，Survivin已經成為惡性腫瘤的一個潛在的早期預測因子。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)廣泛存在于細胞中，在細胞凋亡的執行階段起著至關重要的作用[13-14]。Survivin蛋白通過直接或間接抑制caspase-3和caspase-7的表達，從而抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤的發生和發展。應用蛋白質印跡法和免疫組化法檢測發現，EPS和奧沙利鉑均可降低結腸癌大鼠體內Survivin蛋白的含量，并升高caspase-3和caspase-7蛋白的含量，從而促進腫瘤細胞的凋亡，且聯合用藥的效果更為明顯。

Fig 2 Effect of EPS combined with oxaliplatin on Survivin, caspase-3 and caspase-7 expression in colon

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

Fig 3 Expression of Survivin, caspase-3 and caspase-7 proteins in colon tissues (×400)

綜上所述，本研究表明EPS和奧沙利鉑單獨使用對大鼠結腸癌有明顯的抑制作用，并且聯合使用有良好的協同抑瘤作用，且都具有抑制Survivin蛋白的表達，激活caspase-3和caspase-7信號通路介導的細胞凋亡的作用。本研究為進一步將EPS用于結腸癌的輔助治療提供了依據。