瓜子金皂苷己抑制IL-1β的釋放及其機制研究

龍 倩，王莎莎，邵千航，苑玉和，賀文彬，陳乃宏,,3

(1.山西中醫(yī)藥大學中藥學院，山西 太原 030619；2.中國醫(yī)學科學院神經(jīng)科學中心，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，北京 100050；3.湖南省中藥飲片標準化與功能工程技術(shù)中心，湖南 長沙 410208)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是常見的神經(jīng)退行性疾病，據(jù)統(tǒng)計，我國65歲以上PD患病率高達1.7%，PD患者約為300萬。隨著社會的發(fā)展，人口老齡化現(xiàn)象越來越嚴重，PD患者人數(shù)可能還會持續(xù)增多。PD的主要病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元的變性死亡、紋狀體中DA含量的明顯減少，以及黑質(zhì)殘存神經(jīng)元的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體。目前，臨床上治療PD療效最好、最常用的治療手段是服用左旋多巴作為DA的補充劑。但是左旋多巴治療并不能從PD的發(fā)病機制上逆轉(zhuǎn)PD的發(fā)生，也不能有效延緩PD的病程。長時間服用左旋多巴會引發(fā)惡心、厭食、藥效波動等一系列的副作用，甚至在疾病的晚期，由于藥物抵抗，會加劇和惡化患者的運動障礙，嚴重影響了病人順從性和生活質(zhì)量,且服用時間越長，則毒副反應越明顯、越重[1]。

瓜子金(PolygalajaponicaHoutt)是遠志科遠志屬植物,別名瓜子草、小遠志、銀不換，為多年生草本，主要生長在我國的南方各省。瓜子金常作為民間用藥，藥用其根或全草,具有散郁助眠、益智安神、解毒消腫等功效，常用作治療咽喉腫痛、失眠心悸、毒蛇咬傷等。瓜子金皂苷己(polygalasaponin F，PS-F)是從瓜子金中提取的齊墩果烷型三萜皂苷類化合物。前期實驗室研究發(fā)現(xiàn)，PS-F可以通過維持線粒體功能及抑制caspase-3的激活，對MPP+誘導的PC12細胞凋亡起保護作用[2]；還能通過抑制NF-κB通路的激活及減少p38的磷酸化水平，減少炎性因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、NO的表達量，緩解神經(jīng)炎癥的發(fā)生[3]。本實驗在前期研究基礎上，重點探究PS-F對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)神經(jīng)炎癥模型中IL-1β釋放的影響及其作用機制，為瓜子金用于臨床治療PD提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑BV2細胞為永生化小鼠小膠質(zhì)細胞系，購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學細胞中心，由本實驗室傳代并保存。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清，均購自Gibco公司；LPS、多聚賴氨酸、DMSO、β-actin 抗體，購自Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏發(fā)光液，購自北京普利萊生物技術(shù)有限公司；caspase-1抗體、ASC抗體，購自Santa Cruz公司；caspase-11抗體、IL-1β抗體、NLRP3抗體，購自Abcam公司；ELISA試劑盒由R&D公司提供。

1.2 儀器ThermoForma 3110 型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Spectra Max 190酶標儀 (美國BD公司)；LAS-3000 型化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(日本Fujifilm公司)；蛋白電泳儀(北京六一儀器廠)；PCR反應儀(Eppendorf公司)。

1.3 細胞培養(yǎng)與實驗分組BV2細胞用含10%胎牛血清和鏈霉素100 mg·L-1的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每隔2～3 d進行傳代，選取對數(shù)生長期、狀態(tài)優(yōu)良的細胞進行實驗。實驗分為對照組(加DMEM/F12)、LPS模型組(1 μg·L-1LPS孵育12 h)、LPS+低、中、高劑量PS-F組[1 μg·L-1LPS+PS-F(0.10、1.00、10.00 μmol·L-1)]。

1.4 Western blot檢測蛋白表達選取對數(shù)生長期、狀態(tài)優(yōu)良的BV2細胞，按1×109·L-1接種于用多聚賴氨酸預處理的6孔板中，每孔2 mL，分組同“1.3”。當細胞貼壁長滿70%～80%時，棄掉舊培養(yǎng)基，各組加入混有相應試劑的培養(yǎng)基之后繼續(xù)培養(yǎng)12 h。待處理結(jié)束后，收集細胞，用預冷的PBS洗3遍，加入細胞裂解液，冰浴中裂解30 min后，4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min。BCA蛋白定量，蛋白樣品加相應體積的4×Loading buffer煮沸變性。蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后，濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜，3% BSA室溫封閉2 h，分別加入IL-1β、NLRP3、caspase-1、ASC、caspase-11的抗體，4 ℃過夜，TBS洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，洗膜后，加入ECL液，進行檢測。

1.5 qPCR檢測mRNA的表達分別收集上述各組細胞，用TRIzol提取細胞的總RNA，采用分光光度儀對提取的RNA進行定量，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書加入相應的試劑，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進行實時定量PCR檢測。在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中查詢IL-1β，利用Premier 5.0設計熒光PCR引物，引物序列為F：5′-GTGGCAGCTACCTGTGTCTT-3′，R：5′-GGAGCCTGTAGTGCAGTTGT-3′。反應條件為：95 ℃ 預變性2 min，95 ℃變性10 s、59 ℃ 退火30 s,72 ℃延長30 s, 擴增40個循環(huán)。待反應結(jié)束后，結(jié)合擴增曲線及熔解曲線分析，選擇符合要求的原始數(shù)據(jù)，用GAPDH為內(nèi)參校正，根據(jù)循環(huán)次數(shù)，計算2-ΔΔCT值。

1.6 ELISA法檢測炎性因子IL-1β的釋放情況收集各組經(jīng)12 h刺激后的培養(yǎng)液上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書的具體操作步驟，檢測各組IL-1β釋放的情況。在酶標儀450 nm波長處檢測吸光度值，由標準品的吸光度值與相對應的濃度得到直線回歸方程，并由此計算出各組細胞培養(yǎng)液上清中IL-1β的濃度。

2 結(jié)果

2.1 PS-F對IL-1β蛋白表達、釋放及mRNA水平的影響Western blot結(jié)果顯示(Fig 1A)，與對照組相比，LPS模型組IL-1β的表達量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比， PS-F低、中、高劑量組中IL-1β表達量呈濃度依賴性降低(P<0.05,P<0.01)。PS-F對釋放到培養(yǎng)基中IL-1β的影響如Fig 1B所示，與對照組相比，LPS 模型組釋放到培養(yǎng)基上清的IL-1β含量升高(P<0.01)；與模型組相比，PS-F中、高劑量組的IL-1β釋放量降低，且高劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。IL-1β mRNA的檢測結(jié)果如Fig 1C所示，與Western blot結(jié)果基本一致，與對照組相比，LPS模型組IL-1β mRNA的表達明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，PS-F低、中、高劑量組呈濃度依賴性降低IL-1β mRNA(P<0.01)。

2.2 PS-F對經(jīng)典炎性通路蛋白caspase-1、ASC、NLRP3的影響Fig 2的Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS模型組中NLRP3、caspase-1和ASC的表達量升高，其中ASC、NLRP3的差異有顯著性(P<0.01)；與模型組相比，其表達量在PS-F低、中、高劑量組有一定的降低，且ASC的表達量在高劑量組中差異有顯著性(P<0.05)。

2.3 PS-F通過caspase-11介導的非經(jīng)典炎性通路抑制神經(jīng)炎癥的發(fā)生如Fig 3所示，與對照組相比，LPS模型組caspase-11的表達量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，PS-F高劑量組明顯降低caspase-11的表達(P<0.01)。

3 討論

炎癥是機體對外界刺激的一種防御反應，炎癥的發(fā)生與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展關系密切，與神經(jīng)系統(tǒng)疾患關系最為密切的炎癥反應為神經(jīng)炎癥。炎癥反應是機體抵御感染與損傷復雜的級聯(lián)過程，腦內(nèi)發(fā)生的神經(jīng)炎癥與多種急慢性神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關聯(lián)。近年來，研究表明，神經(jīng)炎癥與PD的病程發(fā)展有著重要的聯(lián)系[4]。小膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)的固有免疫細胞，當腦部受到損傷與感染時，小膠質(zhì)細胞被迅速激活，并伴隨著大量炎性因子的釋放，其中包括IL-1β[5]。PD是僅次于阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease，AD)的第2大神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)于老年人，男性發(fā)病率高于女性。隨著人口老齡化的加劇，PD患者數(shù)量持續(xù)增加，嚴重影響了人們的生活質(zhì)量，也加重了社會的經(jīng)濟負擔。近年來，以神經(jīng)炎癥作為切入點，闡明PD病程的具體機制與開發(fā)神經(jīng)保護作用的藥物成為了研究的熱點，希望通過控制PD發(fā)生、發(fā)展過程中的炎癥反應，實現(xiàn)預防與治療PD的效果。神經(jīng)炎癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫應答反應，具有吞噬作用的小膠質(zhì)細胞充當著外周巨噬細胞樣的功能，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的第一道，也是最主要的免疫防線。在正常成年大腦中，小膠質(zhì)細胞處于靜息狀態(tài)，當腦組織受到各種病理因素的損傷與刺激時，小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)，迅速遷移到損傷部位，對死亡的細胞與組織碎片進行吞噬，釋放出生長因子，促進組織修復。因此，對小膠質(zhì)細胞的適度激活，能夠促進神經(jīng)損傷的恢復，起到神經(jīng)保護作用，但神經(jīng)炎癥的過量發(fā)生，會導致大量炎性因子TNF-α、IL-1β等的釋放，進而加重神經(jīng)元的損傷甚至死亡[6-7]。

Fig 1 Effects of PS-F on IL-1β expression by Western

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS model group

Fig 2 Effects of PS-F on expressions of NLRP3, ASC,

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05vsLPS model group

Fig 3 Effects of PS-F on expression

##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsLPS model group

LPS也稱內(nèi)毒素，是革蘭陰性菌細胞外壁的成分之一，是常用的小膠質(zhì)細胞激活劑，本實驗用LPS刺激小膠質(zhì)細胞構(gòu)建神經(jīng)炎癥模型。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[8]，PS-F能夠明顯減少LPS誘導的小膠質(zhì)細胞中TNF-α、NO、iNOS表達量的增加，那么PS-F對炎性因子IL-1β的釋放是否也有一定的影響呢？本研究圍繞PS-F對神經(jīng)炎癥模型中IL-1β釋放的影響及其具體作用機制展開。首先，檢測了LPS模型與PS-F高、中、低3個劑量組中IL-1β的蛋白表達量及mRNA的水平，Western blot、ELISA、qPCR 3種不同的實驗方法得出一致結(jié)果，其中Western blot、qPCR結(jié)果表明，在LPS神經(jīng)炎癥模型中，IL-1β的釋放量較對照組明顯增多，這與相關文獻報道所得結(jié)果一致[9-10]，PS-F高、中、低劑量組IL-1β較模型組明顯減少。由此證實，PS-F通過抑制炎性因子IL-1β的釋放，降低炎癥反應，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。接下來，對PS-F抑制IL-1β釋放的具體機制展開研究。

炎性因子IL-1β的釋放是細胞內(nèi)信號的級聯(lián)反應過程，與多種促炎信號轉(zhuǎn)導途徑有著密切關聯(lián)，在細胞內(nèi)，有一種“炎性體”的多分子復合物調(diào)控IL-1β的分泌與合成。在探究PS-F減少LPS神經(jīng)炎癥模型中IL-1β合成與分泌，發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥的具體作用機制實驗中，我們針對“炎性小體”展開了一系列的檢測。“炎性體”復合物主要存在于激活的免疫細胞中，介導含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase的激活，進而引起促炎因子IL-18、IL-1β的釋放與宿主細胞的焦亡。炎性體可分為經(jīng)典的炎性體與非經(jīng)典的炎性體兩大類。經(jīng)典的炎性體由胞質(zhì)內(nèi)的模式識別受體(PRR)、caspase和銜接蛋白(apoptosis-associated specklike protein,ASC)三部分組成，它們由模式識別受體直接識別信號[11]。識別受體大致分為NLR家族與PYHIN家族，其中NLRP3炎性小體與PD的發(fā)生與發(fā)展有著重要關系。NLRP3炎性體由NLRP3識別受體、效應蛋白caspase-1以及接頭蛋白ASC三部分組成。當NLRP3被激活時，首先發(fā)生NLRP3的寡聚化，接下來寡聚化的NLRP3會招募接頭蛋白ASC，再之后，與NLRP3結(jié)合的ASC會招募半胱天冬酶原(pro-caspase-1),完成炎性小體的組裝。炎性小體組裝完成之后，會引起pro-caspase-1蛋白的裂解，生成活化的caspase-1，caspase-1又會切割IL-1β前體(pro-interleukin-1 beta, pro-IL-1β)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腎L-1β[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS神經(jīng)炎癥模型中，NLRP3、caspase-1、ASC蛋白的表達量較空白組均增加，其表達量在PS-F給藥組均有所下調(diào)，特別是接頭蛋白ASC的表達量在高劑量PS-F的干預下，較模型組明顯減少。提示PS-F可能通過抑制NLRP3炎性復合體的激活，進而減少炎性因子IL-1β的釋放。

除了經(jīng)典的炎性體，還有一類非經(jīng)典的炎性體，非經(jīng)典的炎性體由含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶11(caspase-11)對信號進行識別并介導，不依賴于傳統(tǒng)的炎性體激活劑[13]。本研究除了檢測經(jīng)典的NLRP3炎性小體在PS-F干預下的變化情況，還檢測了非經(jīng)典炎性體中caspase-11的蛋白含量在各組中的表達。非經(jīng)典的炎性體是由前體caspase-11(pro-caspase-11)與LPS結(jié)合組成的復合物。pro-caspase-11可以與LPS直接結(jié)合，當細胞受到胞內(nèi)LPS的刺激時，迅速發(fā)生寡聚化，產(chǎn)生有活性的caspase-11，之后調(diào)節(jié)炎性因子IL-1β的釋放[14]。這一具體過程尚未完全明確，現(xiàn)有的研究還表明，caspase-11可以影響經(jīng)典的NLRP3炎性體的激活，由此可以明確caspase-11對炎癥發(fā)生的整個過程至關重要。本實驗結(jié)果顯示，LPS誘導的BV2炎癥模型中，pro-caspase-11和caspase-11的表達量較空白組均增多，PS-F干預組的表達均有所下降，特別是caspase-11在高劑量PS-F的干預下，表達量明顯減少。由此得出結(jié)論，PS-F抑制神經(jīng)炎癥，減少LPS誘導的IL-1β分泌增加，也通過非經(jīng)典的炎性體caspase-11途徑發(fā)揮作用。

綜上所述，本實驗證實了PS-F能夠有效減少LPS刺激BV2小膠質(zhì)細胞引發(fā)的炎癥因子IL-1β的釋放，并證實這一過程是通過下調(diào)經(jīng)典的炎性體NLRP3與抑制非經(jīng)典的炎性體caspase-11的激活而實現(xiàn)的。