新型光敏劑光動力治療耐藥胃癌的實(shí)驗(yàn)研究

陳靖京，洪 閣，劉姝萍，劉天軍

(1.長治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系藥理學(xué)教研室，山西 長治 046000；2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所分子設(shè)計(jì)與納米技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192；3.長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院皮膚科，山西 長治 046000)

多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是導(dǎo)致臨床胃癌化療失敗的重要原因[1]。經(jīng)典的耐藥機(jī)制與細(xì)胞膜上P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)過表達(dá)有關(guān)。P-gp由MDR1基因編碼，能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物主動泵至細(xì)胞外，導(dǎo)致化療失敗而產(chǎn)生耐藥[2]。光動力學(xué)療法(photodynamic therapy，PDT)是利用光敏劑在瘤組織的特異蓄積及對瘤組織進(jìn)行激光照射，產(chǎn)生單線態(tài)氧(1O2)等活性氧物質(zhì)，殺滅瘤細(xì)胞[3]。PDT對機(jī)體影響較小，目前已用于多種腫瘤的治療[4-5]。另有研究報(bào)道，PDT可用于多藥耐藥腫瘤的治療[6-7]。Cheung等[8]報(bào)道，脫鎂葉綠酸a-PDT可以進(jìn)一步抑制耐藥子宮肉瘤細(xì)胞P-gp表達(dá)，逆轉(zhuǎn)耐藥。然而，關(guān)于PDT對長春新堿(vincristine，VCR)耐藥胃癌細(xì)胞的治療作用及與P-gp之間的關(guān)系，目前尚未有研究。

光敏劑是PDT的核心元素。本實(shí)驗(yàn)室長期致力于研究和開發(fā)新型光敏劑，尤其是水溶性卟啉的研究。前期研究我們篩選出一種療效較好的新型水溶性卟啉類光敏劑，其化學(xué)名稱為中位取代的5-對二乙基三胺五乙酸基-氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(meso-5-[q-DTPA-aminophenyl]-10,15,20-triphenyl-porhyrin，DTP)。本實(shí)驗(yàn)以VCR耐藥的胃癌細(xì)胞株為研究對象，探索DTP介導(dǎo)的光動力學(xué)治療對耐藥胃癌的作用，并揭示DTP-PDT與P-gp之間的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 ♀裸鼠，4～6周齡，體質(zhì)量16～20 g，由北京華阜康動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2014-0004。實(shí)驗(yàn)過程中動物的使用符合動物倫理委員會的要求。動物均在無特殊病原體條件下飼養(yǎng)，使用墊料為無菌墊料，食用無菌飼料和無菌水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度26～28 ℃，濕度40%～60%，飼養(yǎng)籠具均進(jìn)行消毒。

1.1.2細(xì)胞株 人VCR耐藥胃癌細(xì)胞株SGC7901/VCR，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，為P-gp高表達(dá)。

1.1.3藥物與試劑 新型光敏劑DTP，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子設(shè)計(jì)與納米技術(shù)實(shí)驗(yàn)室合成并提供(結(jié)構(gòu)見Fig 1)，純度大于97%；VCR(批號：20161203)，購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、RPMI 1640培養(yǎng)液，購自北京索萊寶公司；胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；二苯基苯并呋喃(DPBF)、二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司產(chǎn)品；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、抗氧化劑生育酚，購自碧云天公司；P-gp單克隆抗體為BD公司產(chǎn)品。

Fig 1 Chemical structure of DTP

1.1.4儀器 半導(dǎo)體激光器(美國Intense公司)；酶標(biāo)儀(芬蘭Thermo 3001公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences公司)；qTOWER 2.2實(shí)時熒光定量PCR儀(德國ANALYTIKJENA公司)。

1.2 方法

1.2.1DTP紫外吸收光譜測定 用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋DTP母液，使其終濃度為3.12 μmol·L-1。取100 μL藥液加入96孔板內(nèi)，酶標(biāo)儀上檢測藥物在350～750 nm范圍內(nèi)的吸收光譜。實(shí)驗(yàn)同時取100 μL不含DTP的RPMI 1640培養(yǎng)液，以排除稀釋溶劑本身對藥物吸收光譜的影響。

1.2.2DTP-PDT對SGC7901/VCR細(xì)胞生長的影響 將SGC7901/VCR細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，貼壁后，用不同濃度(0～6.25 μmol·L-1)的DTP藥液孵育24 h。行激光照射，光照波長650 nm，能量密度15 J·cm-2，時間15 min，光照后繼續(xù)孵育細(xì)胞24 h。取20 μL MTT溶液加入各孔，孵育3 h。傾去溶液，各孔加入180 μL DMSO，酶標(biāo)儀上振蕩5 min，檢測各孔在490 nm處的吸光度值(OD)，計(jì)算細(xì)胞存活率和半數(shù)有效濃度IC50。實(shí)驗(yàn)同時設(shè)暗毒性組(DTP孵育細(xì)胞，無光照)。

1.2.3體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn) 腫瘤模型制備方法參考文獻(xiàn)[9]。收集1×107個SGC7901/VCR細(xì)胞，接種于裸鼠右后背部。1周后，腫瘤體積大約為150 mm3，將16只裸鼠隨機(jī)分為對照組(生理鹽水，1次)和治療組(DTP，10 mg·kg-1，1次)。生理鹽水或者DTP通過尾靜脈給藥，避光飼養(yǎng)動物。24 h后，用濃度為0.5 mg·kg-1的烏拉坦將動物麻醉，對腫瘤部位進(jìn)行激光照射(其余部位避光)，光照波長650 nm，能量密度100 J·cm-2。21 d后，兩組裸鼠的腫瘤大小用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量，并用以下公式計(jì)算體積：V(cm3)=d2(cm2)×D(cm)/2，d和D分別為腫瘤最短徑和最長徑。

1.2.4DTP-PDT后凋亡檢測 將6孔板中SGC7901/VCR細(xì)胞用不同濃度(0、0.78、1.14、1.56 μmol·L-1)的DTP藥液孵育24 h，行激光照射，波長650 nm，能量密度25 J·cm-2，光照時間15 min。光照后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)3 h，離心、洗滌并收集細(xì)胞。在室溫且避光的條件下，先用濃度為200 mg·L-1的Annexin V-FITC染液染色細(xì)胞10 min，后用30 mg·L-1的PI進(jìn)行染色。隨即用流式細(xì)胞儀分析各樣品細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，分析細(xì)胞數(shù)為104個。

1.2.5DTP-PDT后細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧產(chǎn)率測定 將100 μL濃度為20 μmol·L-1的DPBF溶液與100 μL不同濃度(0.39～6.25 μmol·L-1)的DTP溶液混勻，同時加入或不加80 μmol·L-1單線態(tài)氧捕獲劑生育酚。混合溶液接受激光照射，光照條件同“1.2.2”。實(shí)驗(yàn)另設(shè)DPBF和DTP混合溶液無光照為對照組(二者濃度同上)。各組均加入1 mL氯仿提取DPBF，以得到DPBF的氯仿溶液，用酶標(biāo)儀測定DPBF在410 nm波長處的吸光度值(OD)。DPBF為已知的1O2捕獲劑，在410 nm處有吸收峰。DPBF消耗的相對速率即為1O2的相對產(chǎn)率。計(jì)算公式為：(OD0-OD1)/OD0，OD0為對照組DPBF的OD值；OD1為DTP-PDT組DPBF的OD值。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測DTP-PDT后P-gp表達(dá)變化 光照后3 h，收集6孔板中DTP-PDT處理(DTP濃度為0.78、1.56 μmol·L-1；DTP孵育時間24 h；光照條件：波長650 nm，能量密度為15 J·cm-2，光照時間15 min；80 μmol·L-1的生育酚有或無)和未處理(細(xì)胞未經(jīng)任何處理，對照組)的SGC7901/VCR細(xì)胞。將細(xì)胞重懸于100 μL的PBS中，加入20 μL PE標(biāo)記的P-gp單克隆抗體，在室溫中染色細(xì)胞30 min。PBS洗滌細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測各樣本熒光強(qiáng)度，每個樣本分析104個細(xì)胞，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞表面P-gp表達(dá)水平呈正比。

1.2.7qPCR檢測DTP-PDT后MDR1 mRNA表達(dá)變化 光照后3 h，收集6孔板中DTP-PDT處理(DTP濃度為0.78、1.56 μmol·L-1；藥物孵育時間24 h；光照波長650 nm；能量密度15 J·cm-2，時間15 min；80 μmol·L-1生育酚有或無)及未處理(對照組)的SGC7901/VCR細(xì)胞。用UNIQ-10柱TRIzol總RNA提取試劑盒，根據(jù)說明書提取各組細(xì)胞總RNA。引物使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，MDR1引物上游序列為：5′-GGAACTCAGCTCTCTGGTGG-3′，下游序列為：5′-CTTCTCTGGCTTTGTCCAGG-3′。使用下列循環(huán)條件：95 ℃，5 min；95 ℃，進(jìn)行5 s，共40個循環(huán)；60 ℃，共30 s，在60 ℃這步獲得熒光數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參照基因，結(jié)果使用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算[10]。

1.2.8DTP-PDT與VCR聯(lián)合治療作用 將SGC7901/VCR細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，預(yù)先用不同濃度(0.20～6.25 μmol·L-1)的DTP溶液孵育 24 h。行光動力學(xué)治療，能量密度10 J·cm-2，時間15 min。然后細(xì)胞用不同濃度(1～31.25 μmol·L-1)的VCR溶液孵育24 h。傾去藥液，取100 μL不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液和20 μL MTT溶液依次加入各孔，繼續(xù)孵育3 h，再次傾去液體，每孔加入180 μL DMSO，酶標(biāo)儀上振蕩5 min，檢測各孔在490 nm波長處的吸光度值(OD)，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)分組如下：VCR組、DTP-PDT組及VCR+DTP-PDT組。

1.2.9生育酚對聯(lián)合治療的影響 實(shí)驗(yàn)步驟與“1.2.8”大致相同，不同之處在于各組用上述藥物孵育同時，用80 μmol·L-1的生育酚進(jìn)行孵育，時間24 h。

2 結(jié)果

2.1 DTP紫外吸收光譜分析如Fig 2所示，藥物在不同波長處均有吸收峰，考慮到實(shí)際治療時，光的組織穿透深度與波長呈正比，選擇650 nm作為PDT時的光照波長。

Fig 2 Spectrum property of DTP

2.2 DTP-PDT對SGC7901/VCR細(xì)胞生長的影響Fig 3的MTT結(jié)果顯示，DTP-PDT對SGC7901/VCR細(xì)胞生長有抑制作用，呈明顯的濃度依賴性，IC50值為1.45 μmol·L-1。當(dāng)細(xì)胞僅用DTP孵育而無光照時，細(xì)胞存活率始終>90%，表明DTP本身毒性較小，安全性好。

2.3 體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 4所示，DTP介導(dǎo)的光動力學(xué)治療能夠明顯抑制耐藥腫瘤瘤體的生長。d 21對照組腫瘤體積約為d 0的(190.0±23.2)%，DTP-PDT處理組腫瘤體積約為d 0的(61.0±8.1)%，二者相比差異有顯著性(P<0.05)。

Fig 3 Effects of DTP-PDT and DTP on

*P< 0.05vscontrol

Fig 4 In vivo effects of DTP-PDT in nude mice bearing SGC7901/VCR cells n=6)

A:Tumor inhibition rate after DTP-PDT;B,C:Images of SGC7901/VCR tumors from control and DTP-PDT groups at the 21st day.*P<0.05vscontrol.

2.4 凋亡檢測Fig 5顯示，用不同濃度的DTP-PDT處理細(xì)胞后，SGC7901/VCR細(xì)胞死亡方式主要為凋亡，且呈明顯的量效關(guān)系。

2.5 單線態(tài)氧測定從Fig 6可以看出，隨著DTP濃度的增加，DTP-PDT介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧產(chǎn)率也隨之增加。加入80 μmol·L-1抗氧化劑生育酚，可以明顯抑制細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧的產(chǎn)生。

Fig 5 Apoptosis detection by flow cytometric analysis n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 6 Determination of singlet oxygen generation n=3)

*P<0.05vsDTP-PDT group

2.6 DTP-PDT對P-gp和MDR1 mRNA表達(dá)的影響細(xì)胞膜上過表達(dá)的P-gp對細(xì)胞內(nèi)化療藥物的外排，是導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥形成的重要原因。本實(shí)驗(yàn)研究了DTP-PDT對SGC7901/VCR細(xì)胞膜P-gp表達(dá)的影響。Fig 7結(jié)果顯示，在蛋白水平DTP-PDT可以劑量依賴性地抑制SGC7901/VCR細(xì)胞P-gp的表達(dá)。如Fig 8所示，在基因水平DTP-PDT可以劑量依賴性地抑制P-gp編碼基因MDR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，與Fig 7結(jié)果一致。

Fig 7 P-gp expression after DTP-PDT and effects of α-tocopherol n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vs1.56 μmol·L-1DTP-PDT

2.7 生育酚對DTP-PDT后P-gp和MDR1表達(dá)的影響Fig 7、8結(jié)果顯示，生育酚可以明顯削弱DTP-PDT對P-gp和MDR1 mRNA表達(dá)的抑制作用。

2.8 DTP-PDT與VCR聯(lián)合治療作用本實(shí)驗(yàn)用于評價DTP-PDT和VCR聯(lián)合治療的性質(zhì)：協(xié)同、相加還是拮抗。Fig 9結(jié)果表明，在VCR組、DTP-PDT組及VCR+DTP-PDT組(5 ∶1)，細(xì)胞存活率均隨著藥物濃度的增加而明顯下降，且VCR + DTP-PDT聯(lián)合治療組的細(xì)胞存活率明顯低于同等濃度兩藥的單獨(dú)治療組。采用CalcuSyn軟件對量效曲線圖進(jìn)行分析，并計(jì)算聯(lián)合指數(shù)(CI)：CI< 1.0表示兩藥作用協(xié)同；CI= 1.0表示兩藥作用相加；CI> 1.0表

Fig 8 MDR1 mRNA level after DTP-PDT and effects of α-tocopherol n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vs1.56 μmol·L-1DTP-PDT示兩藥作用拮抗。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)CI< 1.0，表明兩藥合用具有協(xié)同治療作用(Tab 1)。

Fig 9 Combined therapy with DTP-PDT and VCR

2.9 生育酚對聯(lián)合治療的影響Fig 10結(jié)果顯示，80 μmol·L-1的生育酚能夠明顯減弱DTP-PDT對SGC7901/VCR細(xì)胞的增殖抑制，但不影響化療藥VCR對細(xì)胞的抑制作用。同時，生育酚能夠增加聯(lián)合治療的CI指數(shù)(Tab 2)，表明可以一定程度上減弱DTP-PDT與VCR的協(xié)同治療作用。

Tab 1 CI of combined treatment with DTP-PDT and VCR

Tab 2 Effects of α-tocopherol on CI of combined treatment with DTP-PDT and VCR

3 討論

P-gp介導(dǎo)的藥物外排是導(dǎo)致胃癌化療失敗的常見原因，尋求有效的P-gp抑制劑是解決腫瘤耐藥問題的關(guān)鍵。由于PDT作用機(jī)制與化療藥物完全不同，被認(rèn)為在克服多藥耐藥腫瘤上有巨大潛力[6-7]。本實(shí)驗(yàn)研究了一種新型卟啉類光敏劑對VCR耐藥胃癌細(xì)胞SGC7901/VCR的治療作用，以及對P-gp表達(dá)的影響和相關(guān)機(jī)制，能夠?yàn)槟退幬赴┲委熜虏呗缘膶ふ姨峁├碚撘罁?jù)。

本實(shí)驗(yàn)首先評價了DTP-PDT對SGC7901/VCR細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，DTP-PDT對體內(nèi)外培養(yǎng)的耐藥細(xì)胞均有明顯的生長抑制作用，IC50為1.45 μmol·L-1，僅為敏感株(SGC7901細(xì)胞)的1.3倍(數(shù)據(jù)未顯示)。暗毒性結(jié)果表明，DTP在無光照時對細(xì)胞生長無影響，藥物較安全。

Fig 10 Effect of α-tocopherol on combined therapy with DTP-PDT and VCR n=3)

PDT主要是通過產(chǎn)生的單線態(tài)氧來殺傷腫瘤細(xì)胞。本研究測定了細(xì)胞內(nèi)1O2產(chǎn)率。結(jié)果顯示，DTP-PDT后細(xì)胞內(nèi)有1O2產(chǎn)生。給予1O2捕獲劑生育酚后，1O2產(chǎn)生減少，同時DTP-PDT對耐藥細(xì)胞的殺傷作用亦減弱。PDT可通過多種途徑殺傷癌細(xì)胞，如壞死、凋亡、自噬等[11]。Fig 5結(jié)果表明，DTP-PDT后，SGC7901/VCR細(xì)胞死亡方式為凋亡。因此認(rèn)為，DTP-PDT可通過產(chǎn)生1O2，誘發(fā)耐藥細(xì)胞凋亡而介導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。

過表達(dá)的P-gp對藥物的外排是導(dǎo)致化療失敗的重要原因。本實(shí)驗(yàn)研究了DTP-PDT對SGC7901/VCR細(xì)胞P-gp及編碼基因MDR1表達(dá)的影響。結(jié)果表明，DTP-PDT能夠有效抑制耐藥細(xì)胞MDR1 mRNA轉(zhuǎn)錄和P-gp表達(dá)，有望逆轉(zhuǎn)耐藥。生育酚能夠減弱DTP-PDT的這種抑制作用，結(jié)合生育酚是一種1O2捕獲劑，推測DTP-PDT抑制MDR的機(jī)制可能為：DTP-PDT→1O2↑→ MDR1 mRNA轉(zhuǎn)錄↓→P-gp表達(dá)↓，當(dāng)用生育酚捕獲產(chǎn)生的1O2后，MDR1 mRNA轉(zhuǎn)錄和P-gp表達(dá)抑制均減弱。有研究報(bào)道，耐藥細(xì)胞過表達(dá)的P-gp與細(xì)胞內(nèi)1O2水平降低有關(guān)，升高1O2水平可以有效抑制P-gp的表達(dá)[8,12]，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了DTP-PDT與VCR合用對耐藥細(xì)胞的治療作用。結(jié)果顯示，單用DTP-PDT治療有效，單用VCR無效，DTP-PDT/VCR合用比二者單獨(dú)應(yīng)用對SGC7901/VCR細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)。為評價兩藥合用的性質(zhì)是相加、協(xié)同還是拮抗，我們計(jì)算了兩藥合用的聯(lián)合指數(shù)CI。Tab 1結(jié)果顯示CI值均<1.0，認(rèn)為DTP-PDT與VCR合用對SGC7901/VCR細(xì)胞有協(xié)同治療作用，且這種協(xié)同在低濃度時更明顯。關(guān)于協(xié)同機(jī)制，結(jié)合前面研究結(jié)果，推測可能為：DTP-PDT→1O2產(chǎn)生→MDR1 mRNA轉(zhuǎn)錄↓→P-gp表達(dá)↓→細(xì)胞內(nèi)VCR↑→耐藥細(xì)胞恢復(fù)對VCR的敏感性，因此表現(xiàn)為協(xié)同。維拉帕米和環(huán)孢素A為已知的P-gp抑制劑，兩者長期應(yīng)用對機(jī)體有毒副作用[13]。PDT治療時由于僅在光照局部產(chǎn)生反應(yīng)，對機(jī)體的毒副作用較小。聯(lián)合治療方案不僅可以減少化療藥物用藥劑量，減輕副作用，同時可以提高療效，更有利于耐藥腫瘤的治療。因此，DTP-PDT可以作為一種有效的化療輔助手段，用于MDR1相關(guān)耐藥胃癌的治療。

Fig 10和Tab 2的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了兩藥協(xié)同的機(jī)制。當(dāng)加入生育酚后，兩藥合用的CI值均較無生育酚時增加，表明生育酚削弱了DTP-PDT與VCR的協(xié)同作用。基于前面研究結(jié)果，推測原因可能為生育酚捕獲產(chǎn)生的1O2后，導(dǎo)致細(xì)胞P-gp表達(dá)依然很高，細(xì)胞內(nèi)VCR被外排，耐藥細(xì)胞對VCR的敏感性依然較低，從而減弱協(xié)同作用。

綜上所述，新型卟啉類光敏劑DTP-PDT對VCR耐藥胃癌細(xì)胞及其移植瘤的生長有明顯抑制作用，細(xì)胞死亡方式為凋亡；DTP-PDT可以通過產(chǎn)生1O2，抑制耐藥細(xì)胞MDR1基因mRNA和P-gp過表達(dá)，減少P-gp對化療藥物的外排，與化療藥物合用對耐藥細(xì)胞有協(xié)同治療作用。因此，DTP可以作為一個有潛力的光敏劑，用于臨床多藥耐藥胃癌化療的輔助治療。

(致謝：本研究主要在長治醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，動物實(shí)驗(yàn)部分在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所動物實(shí)驗(yàn)中心完成。感謝長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院皮膚科梁艷玲老師在激光器使用過程中給予的技術(shù)指導(dǎo)。)