谷氨酸受體1與鉤藤堿抑制甲基苯丙胺依賴斑馬魚條件性位置偏愛的關系

朱 晨，劉 偉，李 璟，陳志杰，李 嬋，周玉婷，莫志賢

(南方醫科大學1. 中醫藥學院中藥藥理學教研室、2. 中心實驗室，廣東 廣州 510515)

鉤藤堿是常用中藥鉤藤的主要活性成分，長期用于治療中樞神經系統疾病，如高血壓、頭痛、中風等[1]。本團隊前期研究發現，鉤藤堿可以通過減少酪氨酸羥化酶的表達來抑制甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)依賴小鼠產生條件性位置偏愛(conditioned place-preference，CPP)[2]。谷氨酸受體1(glutamate receptor 1，GluR1)是中樞興奮性氨基酸受體，主要分布于突觸前。GluR1是α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異 唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA)受體的關鍵亞型之一，與相應的配體結合后可產生興奮作用[3]。本研究利用斑馬魚作為動物模型，聯合應用行為學、免疫組化、Western blot等方法，研究中藥有效成分鉤藤堿對METH誘導斑馬魚CPP效應的作用機制。

1 材料

1.1 藥品與試劑鹽酸甲基苯丙胺(國家麻醉品實驗室，批號：1212-9802)；鉤藤堿(日本MATSUURA YKUGYO公司)；鹽酸氯胺酮注射液(規格：2 mL ∶0.1 g，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)；3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽(JL160318010，江萊生物公司); 抗GluR1抗體(MAB397，Millipore公司)；魚用生理鹽水，自配，NaCl濃度為100 mmol·L-1。

1.2 儀器Noldus EthoVision XT 8.5軟件(荷蘭Noldus公司)；ChemiImager 550凝膠成像儀(美國Alpha Innotech公司); Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(美國 Media Cybernetics公司)。

1.3 實驗動物斑馬魚(野生型，AB系，6～10個月)，♀♂各半，由南方醫科大學斑馬魚實驗中心提供。養魚系統為北京愛生公司凈水系統(水溫28.5 ℃)；魚用鹽水濃度為0.03%～0.04%；pH值為7.2～7.6；光照條件為14 h光照(8 ∶30 am-10 ∶30 pm)，10 h黑夜(10 ∶30 pm-8 ∶30 am)。

2 方法

2.1 CPP箱的制作斑馬魚CPP箱為長16 cm、寬9 cm、高9 cm的魚缸，魚缸中間插入透明活動擋板將其分隔成兩個箱體，其中一箱體涂成黑色，另一箱體涂成白色。抽開透明擋板時，斑馬魚可在兩箱體間自由活動。

2.2 斑馬魚基線測定斑馬魚適應性喂養2 d后進行基線測定。實驗前，將CPP箱中間的擋板抽開，當斑馬魚進入箱中時開始計時，記錄斑馬魚15 min內在兩箱體的停留時間(以頭部為準)。結果表明，≥95%的斑馬魚天性偏愛黑箱，因此，以在黑箱中的活動時間>8 min為合格，剔除對白箱有明顯偏愛的斑馬魚。

2.3 CPP模型的復制與給藥將篩選合格的斑馬魚隨機分成5組：對照組、模型組、鉤藤堿低劑量組(50 mg·kg-1)、鉤藤堿高劑量組(100 mg·kg-1)、氯胺酮組(150 mg·kg-1)。實驗前,記錄斑馬魚在CPP箱中15 min內的活動。d 1、3、5，除對照組外，其余組斑馬魚8 ∶00 am腹腔注射METH 40 mg·kg-1(對照組注射等體積生理鹽水)，之后放入白箱中訓練45 min；d 2、4，同一時間全部組斑馬魚腹腔注射同體積生理鹽水，之后放入黑箱中訓練45 min。d 1～5，給藥組斑馬魚8 ∶00 pm腹腔注射相應藥物(對照組和模型組則注射等體積生理鹽水)。d 6，記錄各組斑馬魚在CPP箱中15 min內的活動。

2.4 免疫組化法檢測斑馬魚腦GluR1的表達斑馬魚行為學測定結束后，將其冷凍處死，剪下頭部，4%多聚甲醛固定24 h。頭部修剪整齊，進行梯度脫水和石蠟包埋。切片機切片，厚度約5 μm，用防脫載玻片撈起后烤干，進行常規脫蠟和水化。組織切片用PBS緩沖液沖洗后，用3% H2O2內源常溫下封閉10 min后，進行抗原修復。再次清洗之后，滴加5%正常小牛血清常溫封閉20 min。隨后加入一抗GluR1(1 ∶100)，4 ℃過夜;PBS漂洗3次，滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1 ∶200)，常溫 1 h；陰性對照用PBS液代替一抗。

2.5 Western blot檢測GluR1的表達斑馬魚行為學測定結束后，斑馬魚冷凍處死，顯微鏡下取出斑馬魚的腦組織，用RIPA裂解液和PMSF(50 ∶1)提取腦組織蛋白，SDS-PAGE電泳，轉膜，用牛奶常溫封閉2 h，1×TBST清洗3次后，加入稀釋好的一抗GluR1(1 ∶100)，4 ℃過夜；1×TBST清洗3次，滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1 ∶1 000)，常溫1 h。洗去二抗，加入發光液，用凝膠成像儀獲取條帶圖像，以β-actin為內參，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶。

3 結果

3.1 鉤藤堿對METH依賴斑馬魚行為學的影響用Noldus EthoVision XT8.5軟件分析斑馬魚訓練前后在白箱中的逗留時間差及活動軌跡(斑馬魚訓練前后在白箱中逗留時間的差值=斑馬魚訓練后在白箱中的停留時間-斑馬魚訓練前在白箱中的逗留時間)。如Fig 1所示，與對照組相比，腹腔注射METH 40 mg·kg-1后，模型組斑馬魚在白箱中停留時間明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，鉤藤堿高劑量組斑馬魚在白箱中的停留時間明顯減少(P<0.01)。各組斑馬魚造模前后在CPP箱的活動軌跡圖見Fig 2。

3.2 鉤藤堿對METH依賴斑馬魚腦內GluR1陽性細胞數的影響采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，測定各組斑馬魚腦內GluR1陽性細胞的IOD值，每組各項指標的相對含量以平均值表示。如Fig 3所示，與對照組相比，模型組斑馬魚腦內GluR1陽性細胞數明顯上調(P<0.01)；與模型組相比，鉤藤堿低、高劑量組斑馬魚腦內GluR1陽性細胞數明顯下調(P<0.01)。

Fig 1 Change of activity time of zebrafish

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group

Fig 2 Road maps of zebrafish in CPP compartment before and after CPP train

Fig 3 Micrographs of GluR1 positive cells

A: Micrographs of GluR1 positive cells in zebrafish brain; B: The IOD of GluR1 positive cells in zebrafish brain in each group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

3.3 鉤藤堿對METH依賴斑馬魚腦內GluR1蛋白表達的影響如Fig 4所示，各組斑馬魚腦內GluR1蛋白的表達差異具有顯著性。與對照組相比，模型組斑馬魚腦內GluR1表達明顯上調(P<0.01)；與模型組相比，鉤藤堿低、高劑量組斑馬魚腦內的GluR1表達明顯下調(P<0.01)。

4 討論

全球約有3 000多萬人使用安非他明類興奮劑，METH是最常見的安非他明類興奮劑之一，使用率約占71%。METH是一種具有強烈的中樞興奮作用的藥物，長期使用后會造成機體多器官損傷、精神障礙等。

斑馬魚和人類的早期發育極為相似。在基因水平上，斑馬魚與人之間的血液系統、內臟器官、視覺系統、中樞神經系統具有85%的同一性。憑借其良好的繁殖能力、透明胚胎、生長速度和人類基因之間的相似性，斑馬魚受到越來越多生物學家的青睞。

Fig 4 GluR1 expression of zebrafish by Western

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group

一些研究人員成功地建立了斑馬魚藥物依賴CPP模型，斑馬魚在成癮醫學領域的應用被證明是可行的。Cachat等[4]建立了咖啡因、酒精、嗎啡和地西泮的斑馬魚成癮戒斷模型，并指出這些物質可以影響斑馬魚的行為和內分泌，證實斑馬魚可能成為藥物依賴性研究的模型。Ninkovic等[5]的研究表明，腹腔注射D-苯丙胺可以改變成年斑馬魚的位置偏好行為。

在本研究中，CPP測試的結果顯示，與對照組相比，模型組斑馬魚在白箱中的停留時間明顯增加；而在給予氯胺酮和鉤藤堿干預后，與模型組相比，斑馬魚在白箱中的停留時間明顯減少。這表明METH(40 mg·kg-1)可以誘導斑馬魚產生CPP效應，氯胺酮(150 mg·kg-1)和鉤藤堿(100 mg·kg-1)可以逆轉該作用。

大量研究發現，AMPA受體亞基GluR1與藥物成癮密切相關。急性全身注射可卡因和METH，或者伏隔核局部注射安非他明可以引起GluR1含量的增加[6-7]。腹腔注射苯丙胺可以導致大鼠的前額皮質和紋狀體神經元活動的變化，并且引起前額皮質中GluA1磷酸化(pS845)的改變[8]。METH能夠誘導中樞神經系統中谷氨酸水平的升高，而腦內GluR1水平的升高會加速藥物依賴的形成[3]。

在本研究中，與對照組相比，模型組斑馬魚腦內GluR1的表達明顯增強，表明斑馬魚對METH依賴的形成可能與GluR1的表達增加有關。與模型組相比，氯胺酮(150 mg·kg-1)組和鉤藤堿(50、100 mg·kg-1)組斑馬魚腦GluR1表達明顯降低，此生物學結果和行為學結果基本一致。這些結果表明，GluR1可能參與藥物(METH)依賴性形成。現代研究表明，鉤藤對中樞神經系統具有鎮靜、抗癲癇、抗驚厥和對神經元的保護作用等。本團隊早期研究發現，鉤藤堿能明顯拮抗苯丙胺依賴大鼠產生CPP的效應，抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基蛋白表達上調，使METH依賴性大鼠腦內的GluR2/3表達正?；痆9-11]。

綜上所述，鉤藤堿能抑制斑馬魚產生METH依賴，其機制可能與抑制斑馬魚腦內GluR1表達有關。然而，由于中藥的復雜機制，藥物依賴和GluR1的機制仍有待探索。