崖柏組織培養初探

王毅敏 高 晗 高本旺 宋正江 陳發菊

(1.三峽植物園 宜昌 443111；2.三峽大學 宜昌 443000)

崖柏(Thujasutchuenensis)為柏科崖柏屬(Thuja)常綠喬木。有“植物大熊貓”、“活化石”之稱，是我國特有國寶級瀕危植物。因其生長在懸崖峭壁上，故而得名為“崖柏”[1]。它的分布范圍和居群數量己非常有限,僅發現于重慶市城口大巴山自然保護區和開縣雪寶山自然保護區、四川省萬源市花粵山自然保護區和湖北省保康縣五道峽自然保護區[2-3]，現在湖北省興山縣榛子鄉也只發現零星小居群。在實際觀測過程中發現,崖柏居群分布地海拔較高,且常處于陡峭的山脊及山脊兩側,自然條件惡劣(所受風力較大,氣候寒冷),土壤層薄,營養狀況差。現存的崖柏居群,處于島嶼狀的破碎生境中,各個居群植株數量少(而且有效居群大小遠遠低于實際大小),大多呈小喬木或多分枝的大灌木狀態[4]。

崖柏由于自身固有的生物學特性和自然分布區惡劣的生態條件，具有發育緩慢、生殖遲緩、大種子、小收獲量和壽命長的特點。造成結實量低，種源奇缺，且種質差，種子空粒多，種皮堅硬，發芽率低，播種有隔年出苗的習性，靠種子繁殖困難。而利用扦插繁殖存在著年齡效應、位置效應及取材困難等諸多問題[5-6]。崖柏耐干旱適應性強，適宜作為干旱立地條件栽培，目前的研究還處于種苗繁育階段，大大地限制了其推廣。所以，采用組織培養法對崖柏進行離體快速繁殖探索具有重要的理論價值和明顯的現實意義。

1 試驗材料及方法

1.1 試驗材料

試驗材料是2016年4月采自湖北省宜昌市興山縣榛子鄉，選擇尚未木質化的當年生枝條，先用洗潔凈將表面灰塵雜物刷洗干凈，再用流動清水沖洗1.5～2 h，將洗凈后的外植體剪成3～4 cm小段，置燒杯中，晾干備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 0.1%升汞消毒處理外植體效果選擇試驗

外植體先用75%酒精消毒 1 min，無菌水沖洗5次，然后用0.1%升汞消毒處理，無菌水沖洗5次，置無菌紙上，晾干后切成約1～2 cm長帶節莖段作為外植體，接種到事先準備好的無菌培養基上，0.1%升汞消毒時間分別為4、6、8、10、12、14 min，每個處理設3個重復，每個重復接90個。20 d后調查統計污染率、殺傷率，分析適宜的升汞消毒時間。

1.2.2 不同鹽濃度對外植體生長的影響

以MS為基本培養基，調整大量元素的用量，設MS、1/2MS、1/4MS、0MS 4 個濃度梯度培養基，在無菌條件下，將消毒后的外植體切成約1～2 cm長的莖段分別接種到事先準備好的不同鹽濃度的無菌培養基中，共設4個處理，每個處理3個重復，每個重復接30個，置于培養架上培養，30 d后觀察不同鹽濃度對外植體生長的影響，確定適宜的誘導培養基鹽濃度。

1.2.3 統計計算方法

外植體消毒試驗是組織培養獲得無菌系的關鍵，試驗結果統計用到的公式：

污染率(%)=(污染外植體數/接種外植體數)×100(接種20天后統計污染外植體數)

殺傷率(%)=(殺傷外植體數/接種外植體數)×100(接種20天后統計殺傷外植體數)

誘導率(%)=(成苗外植體數/接種外植體數)×100(接種30天后統計統計成苗數)

采用SPSS軟件對不同消毒時間污染率、殺傷率差異進行分析。

2 試驗結果與分析

2.1 0.1%升汞消毒處理外植體效果

統計不同消毒時間處理的三個重復的污染株數計算平均污染率和殺傷率見表1，消毒效果見圖1。

圖1 0.1%Hgcl 不同消毒時間對消毒效果的影響

表1 0.1%升汞不同消毒時間對消毒效果的影響

(注：培養室環境溫度 23～27 ℃，每日光照12～14 h，光照強度1500～2000 Lx ，相對濕度40%～80%。培養基以MS為基本培養基，蔗糖添加量30 g/L，瓊脂4.2 g/L，pH值5.8。)

表2 不同消毒時間污染率和殺傷率分析

用SPSS軟件對污染率和殺傷率進行分析，說明不同消毒時間之間的污染率差異是極顯著的，處理6的污染率最低；處理1～5的殺傷率差異不顯著，處理6的殺傷率最高，故而，綜合考慮污染率和殺傷率的各時間段差異，處理5污染率較低，殺傷率也低，且時間短，所以選處理5。對試驗結果圖表數據綜合分析之后得出：消毒時間在4 min至14 min之間崖柏外植體在0.1%升汞中的消毒效果差異顯著，殺傷率先為零，當消毒時間達到10 min以后殺傷整體趨勢是逐漸增大，當0.1%升汞消毒時間達到12 min(處理 5)的時候污染率低，殺傷率也處于較低水平，表面滅菌效果最好,見表2。

2.2 不同鹽濃度對外植體生長的影響

表3 不同鹽濃度對外植體生長的影響

30天后統計試驗結果(表3)顯示，隨著鹽濃度的降低，平均生長量先升高后降低，生長狀況由MS培養基上的強壯深綠到對照的弱小黃化；葉色隨著鹽濃度的降低而變淺，當大量元素濃度為0時，新生葉黃化或白化。第2組處理 1/2MS 鹽濃度時生長狀況及生長量最好，新生芽深綠健壯，表明鹽濃度過高或過低對外植體生長都不利，比較理想的培養基鹽濃度應該選擇1/2MS。

3 結論與討論

3.1 結論

崖柏外植體外植體先用75%酒精消毒 1 min，無菌水沖洗，0.1%升汞消毒處理隨時間的延長殺傷率增高、污染率降低，0.1%升汞消毒時間達到12 min(處理 5)的時候污染率最低，殺傷率也處于較低水平，表面滅菌效果最好。

培養基鹽濃度過高或過低對崖柏外植體生長都不利，1/2MS 鹽濃度時生長狀況及生長量最好，新生芽深綠健壯。外植體隨著鹽濃度的降低，平均生長量先升高后降低，葉色隨著鹽濃度的降低而變淺，當大量元素濃度為0時，新生葉黃化或白化。

3.2 討論

崖柏組織培養研究未見報道，但近緣植物松科中的雪松、白皮松、金錢松、長白落葉松和興安落葉松，柏科中的黃柏、側柏、絨柏、金黃球柏、叉子圓柏的組織培養國內外有一些報道，大多數研究者選擇生長季節采取外植體，消毒處理后進行培養[7-9]。外植體的消毒方法很多，其中酒精與升汞交互消毒是目前使用廣泛、效果較好的消毒方法。對側柏、絨柏、叉子圓柏、崖柏等柏科植物，枝葉外備較厚角質層，有油脂，消毒滅菌難是普遍問題。用延長消毒時間的辦法來解決這個問題，但消毒時間過長又容易殺傷組織，成活率降低。故而，本試驗選取當年生崖柏莖段做外植體，適宜的消毒時間為75%酒精浸泡1 min，0.1%升汞消毒12 min，效果較好。

齊力旺等(1995)在側柏的組織培養和植株再生試驗研究結果表明，SH培養基不適于側柏組織培養，并篩選出基本培養基為MS培養基[9]。王建華等(2006)在絨柏的組織培養和植株再生,實驗結果表明基本培養基為MS培養基[10]；李春艷等(2000)在臭柏愈傷組織的誘導試驗研究結果表明在離體培養條件下，取當年生叉子圓柏莖尖、莖段、葉及根尖為外植體，在MS培養基上獲得愈傷組織[11]。本試驗以MS培養基為基礎，得到比較理想的崖柏莖段分化誘導產生愈傷組織的培養基為 1/2MS，為今后進一步研究崖柏無菌系建立的方法，建立無菌系繼續擴大基本培養基、生長調節物質和創造利于生根的各種環境等奠定了基礎。