紫杉醇對人鼻咽癌細胞體外自噬的影響

師小徑 鄭明奮 萬仁強 張沈華

[摘要] 目的 探討紫杉醇對人鼻咽癌細胞體外自噬的影響。 方法 體外培養人鼻咽癌細胞系CNE2，采用MTT法檢測紫杉醇對人鼻咽癌細胞系CEN2的增殖抑制，分析紫杉醇對CEN2細胞凋亡的影響;觀察并分析藥物作用后鼻咽癌細胞周期變化及紫杉醇對CNE2細胞的放射增敏作用。 結果 加藥12 h后，存活細胞比例明顯低于對照組（P < 0.05）;加藥48 h后，存活細胞比例明顯低于其他組（P < 0.05）;加藥24 h后，早期凋亡細胞比例最高，明顯高于其他組（P < 0.05）;加藥48 h后，細胞壞死和晚期凋亡細胞比例最高，明顯高于其他組（P < 0.05）。在整個細胞周期中，空白對照組G0/G1周期占比最高，同時明顯高于其他組（P < 0.05）;單純紫杉醇組G2/M周期占比最高，同時明顯高于其他組（P < 0.05）;單純放療組G0/G1、G2/M和S周期的占比比較，差異無統計學意義（P > 0.05）;紫杉醇+放療組G2/M周期占比例最高（P < 0.05）。其中紫杉醇+放療組的細胞凋亡率明顯高于其他組（P < 0.05）。 結論 紫杉醇對人鼻咽癌CNE2細胞有明顯的毒性作用，能抑制人鼻咽癌CNE2細胞的分裂，可一定程度上治療鼻咽癌。隨著紫杉醇濃度的增加，其對CNE2細胞的凋亡作用越強。紫杉醇聯合放療治療可進一步提高CNE2細胞的凋亡率。

[關鍵詞] 紫杉醇;鼻咽癌;細胞自噬

[中圖分類號] R739.6? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（c）-0022-04

ct] Objective To investigate the effect of Paclitaxel on autophagy in human nasopharyngeal carcinoma cells in vitro. Methods Human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2 was cultured in vitro. The proliferation inhibition of Paclitaxel on human nasopharyngeal carcinoma cell line CEN2 was detected by MTT assay. The effect of Paclitaxel on CEN2 cell apoptosis was analyzed. The cell cycle changes and radiosensitization of Paclitaxel on CNE2 cell were observed and analyzed. Results After 12 h of treatment， the proportion of surviving cells was significantly lower than that of the control group （P < 0.05）; after 48 h of treatment， the proportion of surviving cells was significantly lower than that of other groups （P < 0.05）; after 24 h of treatment， the proportion of early apoptotic cells was the highest， significantly higher than that of other groups （P < 0.05）; after 48 h of treatment， the proportion of cell necrosis and late apoptotic cells was the highest， significantly higher than that of other groups （P < 0.05）. In the whole cell cycle， the proportion of G0/G1 cycle in blank control group was the highest， and significantly higher than that in other groups （P < 0.05）; the proportion of G2/M cycle in paclitaxel group was the highest， and significantly higher than that in other groups （P < 0.05）; there was no significant difference in the proportion of G0/G1， G2/M and S cycle in radiotherapy group （P > 0.05）; and the proportion of G2/M cycle in paclitaxel + radiotherapy group was the highest （P <0.05）. The apoptotic rate of paclitaxel + radiotherapy group was significantly higher than that of other groups （P < 0.05）. Conclusion Paclitaxel has obvious toxic effects on human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells， which can inhibit the division of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells， and can treat nasopharyngeal carcinoma to some extent. As the concentration of paclitaxel increases， its apoptosis effect on CNE2 cells is stronger. Paclitaxel combined with radiotherapy can further increase the apoptosis rate of CNE2 cells.

[Key words] Paclitaxel; Nasopharyngeal carcinoma; Cell autophagy

放化療聯合治療是臨床治療頭面部腫瘤的主要方式之一，能降低腫瘤復發和轉移率，提高患者的生活質量水平[1]。但其對腫瘤患者的生存率并無明顯改善。腫瘤是否發生轉移是影響腫瘤患者生存期的重要因素[2]，如何有效局部控制腫瘤一直廣受臨床醫師重視和關注。化療具有增敏放射治療的作用，藥物化療增加了放療的敏感性，增強了放療治療效果[3]。如今臨床上化療藥物較多，包括5-氟尿嘧啶、順鉑、羥基脲、阿霉素等，均能有效提高放療的效果[4]。雖然放射治療提高了化療藥物治療對腫瘤細胞的殺傷力，但正常細胞也會受到相應的損傷[5]。鼻咽癌在臨床上較為常見，一般多采用放療進行治療。大多數放化療主要是通過誘導腫瘤細胞凋亡而抑制腫瘤進一步發展。近年來，細胞自噬在腫瘤治療方面發揮出積極作用。自噬是細胞降解細胞器的唯一途徑，是腫瘤細胞生存所必需的過程。但在某些情況下，持續、過度自噬可導致腫瘤細胞死亡，實現滅殺腫瘤細胞的效果[6]。紫杉醇是臨床常用的化療藥物，具有廣泛的抗癌譜。本研究通過探討紫杉醇對人鼻咽癌CNE2細胞體外自噬的影響，以期為臨床化療聯合放療鼻咽癌提供理論依據，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗材料

所有鼻咽癌CNE2細胞均由中南大學湘雅三醫院耳鼻咽喉頭頸外科提供。

1.2 儀器與試藥

1.2.1儀器? 高速低溫離心機（美國BeckmanGS-15R公司）;流式細胞儀（BD）（日本Shmadzu公司）。

1.2.2 試劑? 紫杉醇（法國Sanofi-Aventis公司）;胎牛血清（美國GIBCO公司）;胰酶（美國Sigma公司）。

1.3 試劑配制

1.3.1 RPMI-1640培養液? 取1640干粉型培養基置于恰當容器，三蒸水溶解，加入1.6 g NaHCO3干粉以及2.38 g HEPES干粉。將所配制的試劑放于離心機上進行充分攪拌，時間30 min，以保證培養基中的干粉溶解完全。將預先配制好的鹽酸溶液緩慢滴入培養液中，攪勻，使pH值調整為7.2～7.4，定容1000 mL，微孔濾過膜濾菌，微孔直徑0.22 μm。加入胎牛血清配置成10%胎牛血清培養液，備用。

1.3.2 PBS緩沖液? 在燒杯中分別加入0.2、0.2、2.9、8.0 g的KCl、KH2PO4、NaH2PO4、NaCl，加入三蒸水至1000 mL，將pH值調至7.2，高壓滅菌并在4℃冰箱中保存備用。

1.3.3 0.25%胰蛋白酶溶液? 將0.25 g胰蛋白酶加入100 mL三蒸水溶解，pH調至7.0，4℃過夜，次日濾菌，配制成0.25%胰蛋白酶溶液。

1.3.4 凍存液? 取PRMI-1640培養液7 mL、胎牛血清2 mL以及DMSO 1 mL混合，4℃保存備用。

1.3.5 MTT溶液? 25 mg MTT干粉加入磷酸緩沖鹽（PBS）溶液5 mL，充分攪拌30 min，4℃保存。提取保存在液氮罐中的CNE2細胞，37℃水浴解凍并吸出懸浮細胞，將10 mL PRMI-1640溶液加入裝有細胞懸液的離心管中。1000 r/min離心5 min，去除上清液，漂洗離心培養基后，加入培養液，使培養液覆蓋瓶底，37℃下進行培養。當細胞生長至覆蓋瓶底70%時可傳代。PBS洗滌兩次，加入0.2 mL胰酶，顯微鏡下若觀察到細胞固縮，則立刻停止消化，加入3 mL培養液，敲打時瓶底細胞脫落。分裝細胞懸液，加入培養液至5 mL，放入培養箱中培養。

1.3.6 紫杉醇培養基? 逐步稀釋含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基至各濃度。

1.4 MTT法檢測紫杉醇對CNE2細胞的毒性作用及IC50

①取對數期生長的CEN2細胞，制備單細胞懸液1×105/mL;②取96孔板，分別加入200 μL單細胞懸液進行培養;③CEN2細胞貼壁后分別加入不同濃度的紫杉醇培養液，濃度分別為0.015、0.06、0.25、1、4、16、64 μg/mL。每個濃度均設置6個復孔，同時設立對照組，對照組加入生理鹽水作為對照;④其后，37℃恒溫箱中培養48 h，去除陳舊培養基及藥物;⑤每孔加入20 μL MTT溶液，再次孵育4 h;⑥去除MTT溶液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）溶液，振蕩10 min;⑦在490 nm處采用酶標儀測量OD值;⑧根據所測OD值計算紫杉醇對CEN2細胞的抑制率和IC50。

1.5 流式細胞儀檢測不同紫杉醇濃度及作用不同時間對CNE2細胞凋亡的影響

1.5.1 AnnexinV/PI雙雜流式細胞術檢測紫杉醇對CNE2細胞的誘導凋亡作用? ①于6孔板中種植CNE2細胞，分為加藥12 h組、加藥24 h組、加藥48 h組，待細胞貼壁后加入4 μg/mL紫杉醇;②于加入紫杉醇12、24、48 h后收集細胞并制成單細胞懸液，1000 r/min旋轉離心5 min，后棄上層血清。PBS溶液洗滌3次;③將細胞重懸，加入200 μL緩沖液，細胞密度調至1×106個/mL;④取195 μL細胞懸液加至AnnexinV-FITC溶液5 μL混勻，避光放置10 min;⑤結合緩沖液進行清洗，采用離心機，1000 r/min旋轉離心5 min，后棄去上清液，重新懸浮于190 μL配好的緩沖液中;⑥加入10 mL PI（20 μg/mL），室溫下避光孵育5 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5.2 紫杉醇對CNE2細胞凋亡率和周期的影響? ①細胞分組：將CNE2細胞分為空白對照組、單純紫杉醇組、單純放療組以及紫杉醇+放療組（放療方法：鼻咽部治療采用6 mV光子線照射，劑量72～76 Gy，照射36～38次，治療8周。）;②接種CNE2細胞于6孔板上，等待細胞貼壁;③待CNE2細胞貼壁后將細胞懸浮、消化、洗滌、離心;④采用70%乙醇固定，-20℃保存;⑤再取1×106個細胞，1000 r/min離心5 min，棄上清液，3 mL PBS懸浮細胞;⑥400目篩網過濾，1000 r/min離心5 min，棄除PBS;⑦加入PI染液和RNA酶各1 mL，4℃下避光反應30 min;⑧流式細胞儀檢測。

1.6 觀察指標

所有實驗步驟重復3次，取平均值，觀察紫杉醇作用不同時間對CNE2細胞的影響以及紫杉醇和放療對CNE2細胞周期分布的影響。

1.7 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗;計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紫杉醇作用不同時間對CNE2細胞的影響

加藥12 h和加藥24 h后存活細胞明顯低于對照組，加藥48 h后存活細胞比例明顯低于其他組（均P < 0.05）;加藥24 h早期凋亡細胞比例最高，明顯高于其他組（P < 0.05）;加藥48 h細胞壞死和晚期凋亡細胞比例最高，明顯高于其他組（P < 0.05）。見表1。

2.2 紫杉醇和放療對CNE2細胞周期分布的影響

在整個周期中，空白對照組G0/G1周期的占比最高，同時明顯高于其他組（P < 0.05）。單純紫杉醇組G2/M周期占比最高，同時明顯高于其他組（P < 0.05）。單純放療組G0/G1、G2/M和S周期的占比比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。紫杉醇+放療組G2/M周期占比最高（P < 0.05）。其中，紫杉醇+放療組凋亡率明顯高于其他組（P < 0.05）。見表2。

3 討論

鼻咽癌在臨床上較為常見，臨床主要采用放療法進行治療，放療聯合化療是臨床治療鼻咽癌的標準方案[7]。雖然放療技術和設備在不斷進步，但鼻咽癌患者預后生存率仍然不高[8]。

近年來，隨著紫杉醇在臨床上的廣泛應用，其對各種惡性腫瘤的放化療起到了促進作用[9]。報道[10]顯示，紫杉醇聯合順鉑以及5-氟尿嘧啶進行化療，其化療效果相對于順鉑聯合5-氟尿嘧啶更顯著，且細胞毒性反而更低。而其他研究[11]中也報道，紫杉醇在治療鼻咽癌中具有良好效果。

紫杉醇是一種植物類抗癌藥，由太平洋紫杉樹的樹皮和針葉中提取而出，具有抗癌作用[12]。其作用與細胞骨架的維管系統，通過與β-微管蛋白氨基酸的結合，促進微管蛋白的結構穩定性，阻斷細胞周期G2/M期干擾細胞分裂，從而促進放療效果[13-14]。本研究采用紫杉醇對人鼻咽癌CNE2細胞進行處理，觀察不同濃度紫杉醇以及紫杉醇和放療對鼻咽癌CNE2細胞的影響。結果顯示，紫杉醇濃度越高，存活細胞比例越低，而壞死和晚期凋亡細胞比例明顯升高。提示紫杉醇具有較強的細胞毒性，其濃度升高時，紫杉醇對CEN2細胞具有較強的殺傷作用。紫杉醇作用12 h，即出現了細胞凋亡現象;紫杉醇作用24 h，早期凋亡最明顯;紫杉醇作用48 h，早期凋亡降低，但CNE2大量壞死和晚期凋亡，可見紫杉醇對CNE2細胞具有明顯抑制作用，早期主要為細胞凋亡，晚期為細胞壞死。細胞凋亡與腫瘤發生發展息息相關[15]。目前認為可能引起腫瘤的原因[16]為：①可誘導凋亡細胞基因的失活，導致凋亡基因表達水平較高;②機體免疫導致腫瘤細胞凋亡功能喪失;③宿主細胞抑制腫瘤細胞凋亡。而紫杉醇引起鼻咽癌CNE2細胞凋亡的機制可能與紫杉醇影響細胞內各蛋白的表達有關。王娜等[17]的研究顯示，Bcl-2、Bax、Cox-2、Cyclin-D1及Caspase-3等基因表達水平與腫瘤細胞凋亡功能有密切關系。

還有研究[18]顯示，紫杉醇對腫瘤放療具有增敏作用，但目前紫杉醇對腫瘤放療的增敏作用機制尚未完全明確。部分學者[19]認為這可能與紫杉醇抑制了放療后引起的細胞潛在性致死損傷修復功能有關。大部分學者更偏向與細胞不同周期對射線敏感性不同的理論[20]。在細胞周期中以G2/M期為最敏感的時期，S期為最不敏感期。通常認為將細胞滯留與G2/M期是放療效果最好的時期。本研究發現，單純紫杉醇作用的CNE2細胞停留在G2/M期的比例高達80%，提示紫杉醇具有漿細胞阻滯在G2/M期的作用，從而增加細胞對射線的敏感程度，提高放療效果。紫杉醇聯合放療治療后，細胞凋亡率高達55.62%，明顯高于其他組，也進一步提示紫杉醇對放療具有增敏作用，提高了放療對CNE2細胞的殺傷力，從而達到殺滅腫瘤細胞的效果。

綜上所述，紫杉醇對人鼻咽癌CNE2細胞具有明顯的細胞毒性作用和抑制分裂效果，可一定程度上起到治療鼻咽癌的作用。隨著紫杉醇濃度的增加，其對CNE2細胞的凋亡作用越強。紫杉醇聯合放療治療可進一步提高CNE2細胞的凋亡率。

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（收稿日期：2018-02-09? 本文編輯：王? ?蕾）