Genistein對大鼠卵巢顆粒細胞CREB基因表達的影響

溫海霞 肖曉輝 孟毅 程丹玲

[摘要] 目的 觀察Genistein對大鼠卵巢顆粒細胞cAMP反應元件結合蛋白（CREB）基因表達的影響及其與雌激素受體（ER）的關系。 方法 分離大鼠卵巢顆粒細胞進行培養，分別給予Genistein（0.1、1、5、10、100 μmol/L）及ER阻斷劑ICI182，780（1 μmol/L）處理24 h后，采用RT-PCR檢測CREB mRNA的表達。 結果 1、5和10 μmol/L Genistein組CREB mRNA表達顯著高于空白對照組（P < 0.05或P < 0.01）。細胞預先加入ER阻斷劑ICI182，780處理30 min后，再加入1、10 μmol/L Genistein處理24 h組，CREB mRNA表達與1、10 μmol/L Genistein組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。 結論 1～10 μmol/L的Genistein可上調大鼠卵巢顆粒細胞CREB基因的表達，但可能并非通過ER介導。

[關鍵詞] Genistein;卵巢顆粒細胞;cAMP反應元件結合蛋白;雌激素受體

[中圖分類號] R339.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（c）-0019-03

[Abstract] Objective To investigate the effects of Genistein on the gene expression of cAMP response element binding protein （CREB） in the rats ovarian granulosa cells and the relationship with the estrogen receptor （ER）. Methods The ovarian granulosa cells from female rat were isolated and collected， incubated and treated with Genistein （0.1， 1， 5， 10， 100 μmol/L） and ER blocker ICI182， 780 （1 μmol/L） for 24 h. Then the CREB mRNA expression level was assessed by RT-PCR. Results Compared with the control group， the expression of CREB mRNA of 1， 5 and 10 μmol/L Genistein group was higher （P < 0.05 or P < 0.01）. After the cells pretreated with ER blocker ICI182， 780 for 30 min， 1， 10 mol/L Genistein added and pretreated 24 h group， the expression of CREB mRNA had no significant difference compared with the 1， 10 μmol/L Genistein group （P > 0.05）. Conclusion 1-10 μmol/L Genistein could up-regulate the expression of CREB gene in the rats ovarian granulosa cells. The molecular mechanism of Genistein effect on the CREB gene expression may not be mediated by ER.

[Key words] Genistein; Ovarian granulosa cells; cAMP response element binding protein; Estrogen receptor

Genistein是一種植物雌激素，具有強抗氧化性和多重腫瘤抑制效應[1-3]，并能雙向調節雌激素受體（estrogen receptor，ER）[4-6]。研究[7]發現，Genistein可誘導芳香化酶基因轉錄，增加局部雌激素合成。在卵巢顆粒細胞，芳香化酶的活性主要受卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）調節[8]，后者通過FSHR-AC-cAMP-PKA途徑，激活cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB），進而始動芳香化酶基因轉錄[9-10]。我們在前期研究發現，一定濃度的Genistein可影響卵巢顆粒細胞芳香化酶基因表達，但是否經由ER介導，并進而影響CREB轉錄，目前尚不清楚。因此，本研究采用細胞培養、逆轉錄PCR等分子生物學技術，觀察Genistein對雌性大鼠的卵巢中顆粒細胞CREB基因表達的影響，進一步使用ER-α的阻斷劑ICI182，780觀察Genistein上述作用與ER的關系，初步揭示Genistein調節卵巢局部內分泌功能的分子機制。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

健康雌性SD大鼠，25～28 d齡，體重60～80 g，哈爾濱醫科大學附屬第二醫院實驗動物中心提供，自動控制光照，自由攝食、飲水。實驗動物使用許可證號：（黑）2013-002。

1.2 主要儀器

PCR擴增儀（PTC-100型，美國MJ.Research公司）;GIS凝膠成像及分析系統（上海天能生物公司）。

1.3 主要試劑

Genistein（美國Sigma公司）;17β-雌二醇（17β-E2，美國Sigma）;ICI182，780（美國Sigma）;小牛血清白蛋白（BSA，美國Sigma）;孕馬血清促性腺激素（PMSG，天津華孚高新生物技術公司）;Trizol（美國Invitrogen公司）;BcaBESTTM RNA PCR試劑盒（大連Takara Nilestriol公司）;PCR引物（上海英駿生物有限公司）。

1.4 實驗分組及處理

未成年大鼠頸后皮下注射PMSG，60 U/只，48 h后急性斷頭處死，立刻剝離出雙側卵巢，針刺卵泡充分釋放出顆粒細胞，過濾、沖洗、離心后，用新鮮配制的DMEM/F12培養液（含青、鏈霉素）調整細胞濃度至3×105/mL。細胞懸液分裝至6孔培養板，37℃的5%CO2培養箱中培養48 h后，分別加入不同濃度Genistein（GEN）、17β-E2及ICI182，780（ICI）等因素處理。

實驗共分9組：①空白對照組（0 μmol/L GEN組）;②0.1 μmol/L GEN組;③1 μmol/L GEN組;④5 μmol/L GEN組;⑤10 μmol/L GEN組;⑥100 μmol/L GEN組;⑦17β-E2（10 nmol/L）組;⑧1 μmol/L ICI預處理30 min后加1 μmol/L GEN組;⑨1 μmol/L ICI預處理30 min后加10 μmol/L GEN組。因素處理細胞24 h后，收集至1.5 mL Eppendorf管中，-70℃保存，用于總RNA提取和RT-PCR。見表1。

1.5 實驗方法

利用RT-PCR技術檢測CREB mRNA表達。先使用Trizol提取細胞總的RNA，按PCR試劑盒說明書逆轉錄。利用Gene Runner軟件進行設計引物，β-actin作為內參。PCR反應的擴增條件為94℃預變性1 min，94℃變性4 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環次數為38次，72℃充分延伸10 min。擴增產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統拍照并進行條帶灰度分析，以目標基因CREB與內參β-actin灰度的比值代表CREB的相對表達量。實驗重復3次。CREB及β-actin的引物序列及產物長度見表2。

1.6 統計學方法

采用SPSS 11.5對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠卵巢顆粒細胞CREB mRNA的表達情況

通過逆轉錄PCR電泳及成像結果顯示，實驗各組均擴增出一條CREB片段，大小約256 bp。

2.2 Genistein對大鼠卵巢顆粒細胞CREB mRNA表達的影響

電泳條帶的灰度分析顯示：1、5和10 μmol/L Genistein組及10 nmol/L 17β-E2組CREB mRNA表達量與空白對照組比較均明顯增加（P < 0.05或P < 0.01）。細胞預先加入ER阻斷劑ICI182，780培養30 min后，再分別加入1 μmol/L和10 μmol/L Genistein繼續處理細胞24 h，H組與D組、I組和F組比較，CREB mRNA表達水平差異均無統計學意義（P > 0.05）。

3 討論

近年來發現，Genistein可增加人卵巢癌細胞A2780對順鉑等常規化療藥物的敏感性[10]，并能調節雌性哺乳動物內分泌活動[11-13]。本研究[14-16]前期在體實驗也發現，Genistein可上調衰老大鼠卵巢ER-α表達，并促進雌激素生成關鍵酶芳香化酶基因表達，但具體機制尚不十分清楚。

CREB是細胞內的第三信使，定位于細胞核內，作為一個重要的轉錄因子，可影響芳香化酶基因轉錄水平[17]。研究[18]發現，Genistein能夠通過激活PKC和P38而促使DNA結合FSHR下游因子CREB和芳香化酶基因的轉錄。本研究觀察了Genistein對大鼠卵巢顆粒細胞CREB mRNA表達的影響，發現1、5、10 μmol/L Genistein作用顆粒細胞24 h，均可增加CREB mRNA表達，并且這種作用不被ER阻斷劑ICI182，780所抑制，提示Genistein對芳香化酶基因上游調控因子CREB的激活可能并非通過ER介導。

研究[20]發現，Genistein可影響子宮內膜芳香化酶啟動子Ⅰ的表達，是通過一種新型膜性G蛋白偶聯雌激素受體（G protein coupled estrogen receptor，GPER）介導，與經典ER無關。那么Genistein影響卵巢芳香化酶及上游CREB的表達是否經由GPER介導，尚需進一步研究。

[參考文獻]

[1]? Chen MN，Lin CC，Liu CF. Efficacy of phytoestrogens for menopausal symptoms：a meta-analysis and systematic review [J]. Climacteric，2015，18（2）：260-269.

[2]? Wagner JD，Anthony MS，Cline JM. Soy phytoestrogens：research on benefits and risks [J]. Clin Obstet Gynecol，2001， 44（4）：843-852.

[3]? Takagi A，Kano M，Kaga C. Possibility of breast cancer prevention：use of soy isoflavones and fermented soy beverage produced using probiotics [J]. Int J Mol Sci，2015，6（5）：10 907-10 920.

[4]? Varinska L，Gal P，Mojzisova G，et al. Soy and breast cancer：focus on angiogenesis [J]. Int J Mol Sci，2015，16（5）：11 728-11 749.

[5]? Spagnuolo C，Russo GL，Orhan IE，et al. Genistein and cancer：current status，challenges，and future directions [J]. Adv Nutr，2015，6（4）：408-419.

[6]? Siow RC，Mann GE. Dietary isoflavones and vascular protection：activation of cellular antioxidant defenses by SERMs or hormesis [J] Mol Aspects Med，2010，31（6）：468-477.

[7]? Ye L，Chan MY，Leung LK. The soy isoflavone genistein induces estrogen synthesis in an extragonadal pathway [J]. Mol Cell Endocrinol，2009，302（1）：73-80.

[9]? Casarini L，Moriondo V，Marino M，et al. FSHR polymorphism p.N680S mediates different responses to FSH in vitro [J]. Mol Cell Endocrinol，2014，393（1/2）：83-91.

[10]? Ghosh S，Lu Y，Hu Y. A Role of CREB in BRCA1 Constitutive Promoter Activity and Aromatase Basal Expression [J]. Int J Biomed Sci，2008，4（4）：260-265.

[11]? Solomon LA，Ali S，Banerjee S，et al. Sensitization of ovarian cancer cells to cisplatin by genistein：the role of NF-kappaB [J]. J Ovarian Res，2008，1（1）：9-15.

[12]? 李超，劉艾林，杜冠華.天然異黃酮類化合物的藥理學研究進展[J].中國新藥雜志，2013，22（12）：1415-1420.

[13]? Spagnuolo C，Russo GL，Orhan IE，et al. Genistein and cancer：current status，challenges，and future directions [J]. Adv Nutr，2015，6（4）：408-419.

[14]? 肖曉輝，趙薇，劉國藝，等.大豆異黃酮對衰老大鼠卵巢芳香化酶表達的影響[J].生理學報，2006，58（supple 1）：178.

[15]? 張翼鴻，龐海燕，肖曉輝，等.大豆異黃酮及其主要活性成分genistein對大鼠卵巢雌激素受體α表達的影響[J].中華醫學雜志，2011，91（28）：1987-1991.

[16]? 龐海燕，孟毅，趙薇，等.大豆異黃酮及主要活性成分Genistein對大鼠卵巢LRH-1基因表達的影響[J].國際遺傳學雜志，2012，35（3）：151-156.

[17]? Samarajeewa NU，Docanto MM，Simpson ER，et al. CREB-regulated transcription co-activator family stimulates promoter Ⅱ-driven aromatase expression in preadipocytes [J]. Horm Cance，2013，4（4）：233-241.

[18]? Xi YD，Zhang DD，Ding J，et al. Genistein Inhibits Aβ25-35-Induced Synaptic Toxicity and Regulates CaMKⅡ/CREB Pathway in SH-SY5Y Cells [J]. Cell Mol Neurobiol，2016，36（7）：1151-1159.

[19]? Zhou Y，Xu JN，Zeng C，et al. Metformin Suppresses Pro-staglandin E2-Induced Cytochrome P450 Aromatase Gene Expression and Activity via Stimulation of AMP-Activated Protein Kinase in Human Endometriotic Stromal Cells [J]. Reprod Sci，2015，22（9）：1162-1170.

[20]? 印德嬌，朱彥鋒，劉林夕，等.大豆異黃酮對大鼠睪丸支持細胞的影響[J].中南大學學報：醫學版，2014，39（6）：598-604.

[21]? Smith HO，Arias-Pulido H，Kuo DY，et al. GPR30 predicts poor survival for ovarian cancer [J]. Gynecol Oncol，2009，114（3）：465-471.

（收稿日期：2016-10-21? 本文編輯：金? ?虹）