殼寡糖對高脂飲食誘發肥胖小鼠脂肪組織內質網應激水平及炎性因子釋放的影響

楊碩 王斌 夏文水

[摘要] 目的 研究殼寡糖對高脂飲食誘導肥胖小鼠脂肪組織內質網應激及炎性因子釋放的影響。 方法 30只C57BL/6J小鼠以隨機數字表法分成正常飲食組（Control組）、高脂飲食組（HF組）和高脂飲食+殼寡糖組（HF+COS組），每組10只。喂養16周后進行葡萄糖耐量試驗和胰島素耐量試驗;收集血清，檢測血脂情況;稱取小鼠體重、腎周及皮下脂肪組織，比較各組脂肪累積情況;檢測脂肪組織中內質網應激標志蛋白葡萄糖調節蛋白（GRP-78）、內質網激酶（PERK）mRNA及蛋白表達，檢測脂肪組織核因子-κB（NF-κB）炎癥通路變化。 結果 與Control組比較，HF組小鼠血糖、血脂、體重、腎周及皮下組織脂肪細胞體積及重量均明顯增加（P < 0.05或P < 0.01），GRP-78、PERK mRNA及蛋白表達增加（P < 0.05），NF-κB通路激活。與HF組比較，HF+COS組上述指標除總膽固醇外均明顯降低（P < 0.05）。 結論 殼寡糖可以降低高脂飲食喂養肥胖小鼠血脂，減輕脂肪組織過度積累，緩解內質網應激，并可能通過抑制NF-κB的激活減少炎性因子釋放，從而達到緩解胰島素抵抗的作用。

[關鍵詞] 殼寡糖;脂肪組織;內質網應激;核因子-κB;胰島素抵抗

[中圖分類號] R587? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（c）-0009-07

[Abstract] Objective To investigate the effect of chitosan oligosaccharide on the level of endoplasmic reticulum stress and inflammatory factors released in adipose tissue of obese mice induced by high-fat diet. Methods Thirty C57BL/6J mice were divided into normal diet group （Control group）， high-fat diet group （HF group） and high-fat diet+chitosan oligosaccharide group （HF+COS group） according to random number table method， with 10 mice in each group. After being fed for 16 weeks， glucose tolerance test and insulin tolerance test were carried out. Serum was collected to detect lipid profiles， mice body weights， perirenal and subcutaneous adipose tissue weights were estimated within groups. In addition， the protein and mRNA expression of endoplasmic reticulum stress markers glucose regulatory protein （GRP-78） and endoplasmic reticulum kinase （PERK） from adipose tissue were assessed. Meanwhile， the changes of nuclear factor-κB （NF-κB） inflammatory pathways in adipose tissue were also detected. Results Compared with the control group， the levels of glucose， lipid， the body weights and the size and weight of perirenal and subcutaneous adipocytes in HF group were significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）， the mRNA and protein expression of GRP-78 and PERK were increased significantly （P < 0.05）. And the activation states of NF-κB pathway was measured accordingly. Compared with HF group， except for total cholesterol， the mentioned indicators in HF+COS group were significantly decreased （P < 0.05）. Conclusion Chitosan oligosaccharide can lower blood lipids， reduce the excessive accumulation of adipose tissue and relieve endoplasmic reticulum stress in mice fed on high-fat diet. Chitosan oligosaccharide inhibits the activation of NF-κB， resulting in the reduced release of inflammatory factors which is likely to contribute to the insulin resistance alleviation.

[Key words] Chitosan oligosaccharide; Adipose tissue; Endoplasmic reticulum stress; Nuclear factor-κB; Insulin resistance

肥胖是21世紀嚴峻的健康問題，最新數據表明全球超過4億人屬于肥胖[1]。肥胖患者脂肪組織中存在內質網應激（ERS）[2]。研究表明肥胖患者往往處于慢性炎癥狀態，當脂肪細胞發生ERS時，炎性因子表達增加，最終可能導致胰島素抵抗的發生[3]。殼寡糖（chitosan oligosaccharides，COS）是一種天然的水溶性低聚糖，主要提取自海洋生物的甲殼[4]，具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化及神經保護等功能[5-7]。本研究主要探討殼寡糖對高脂飲食誘發肥胖的C57BL/6J小鼠脂肪組織胰島素抵抗的緩解作用，以期為殼寡糖的生物活性應用提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物? 6周齡C57BL/6J小鼠（18～20 g）30只，健康SPF級，雄性，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[合格證號：SCXK（滬）2007-0005]，12 h明暗光源交替，溫度（22±2）℃，相對濕度60%飼養環境。

1.1.2 試劑與儀器? 殼寡糖（脫乙酰度90%，分子量1500 Da，浙江金殼藥業有限公司）;引物由英俊生物技術有限公司提供;TRIzol試劑（ThermoFisher scientific，10296010）;RNAiso Plus試劑盒（Takara，9108）;SYBR Green（DBI Bioscience，DBI-2043）;抗GAPDH抗體（Santa Cruz，sc166545），兔抗鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α（ab6671）、白細胞介素（IL）-6（ab128008）、葡萄糖調節蛋白（GRP）-78（ab21685）、內質網激酶（PERK）（ab79483）、磷酸化-核因子-κB抑制蛋白（p-IκB）（ab32518）、核因子-κB（NF-κB）p65（ab16502）、β-actin（ab8227）和Lamin（ab16048）均購自Abcam。電泳儀（北京六一儀器廠，DYCZ-25D）;低溫高速離心機（Eppendorf，5810R）;熒光定量PCR儀（CFX96 TM Real-Time System）。

1.2 方法

1.2.1 肥胖小鼠造模及分組? 采用隨機數字表法將C57BL/6J小鼠分為正常飲食組（Control組）、高脂飲食組（HF組）和高脂飲食+殼寡糖組（HF+COS組），每組10只。喂養16周，遵守江南大學實驗動物倫理委員會規定。HF組給予45%熱量高脂飼料（2.9%大豆油、20.7%豬油、46.1%碳水化合物和23.3%蛋白質）[8-9]，HF+COS組高脂飼料中添加5%質量分數殼寡糖[10]，劑量符合毒理安全評價[11]。小鼠體重顯著上升被認為成功建模。

1.2.2 葡萄糖耐量試驗（GTT）和胰島素耐量試驗（ITT）? 小鼠禁食5 h后灌胃給予葡萄糖溶液（2 g/kg），分別于0、30、60、90、120 min時鼠尾采血（5～10 μL）進行GTT試驗;ITT試驗前小鼠禁食5 h，腹腔注射胰島素（0.75 U/kg）。分別在注射前（0 min）及注射后30、60、90、120 min鼠尾采血，血糖儀測量血糖水平，計算葡萄糖曲線下面積（AUC）。

1.2.3 小鼠標本留取? 每周測量小鼠體重，滿16周禁食過夜，次日麻醉脫頸處死，腹主動脈取血，制備血清檢測總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和游離脂肪酸（FFA）的濃度。鈍性分取腎周及皮下脂肪組織，一部分立即10%甲醛固定，另一部分液氮快速凍存后置于-80℃冰箱中備用。

1.2.4 HE染色形態學觀察? 每只小鼠的腎周及皮下脂肪組織均于甲醛固定，石蠟包埋切片，常規HE染色，光鏡拍照，每個組織隨機選取5個視野（200×），測定約200個細胞的大小。

1.2.5 免疫組化分析? 脂肪組織制片，抗原修復，3%過氧化氫10 min滅活。山羊血清封閉，分別滴加一抗IL-6（1∶200）和TNF-α（1∶300）4℃孵育過夜。PBS清洗后加二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察并拍照，每張切片隨機選取5個視野，采用Image-Pro圖像分析軟件進行灰度分析（IOD）。

1.2.6 實時熒光定量? 稱取80 mg皮下脂肪組織，采用Trizol法提取皮下脂肪組織總RNA，應用逆轉錄高效試劑盒獲取cDNA，操作按試劑盒說明進行。應用熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR擴增，引物信息見表1。以β-actin的表達量作為內參，每個標本設置3個復孔，取復孔平均Ct，通過計算2-ΔΔCt得出各組基因的相對表達水平。

1.2.7 Western blot? 分別稱取100 mg小鼠皮下脂肪組織，總蛋白及核蛋白的提取操作參照試劑盒說明書。SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉膜，采用含5%脫脂奶粉TBST溶液封閉1 h，孵育一抗GRP-78（1∶1000）、PERK（1∶1000）和p-IκB（1∶1000）及核蛋白一抗NF-κB p65（1∶500），4℃過夜，次日洗膜，孵育二抗，37℃ 1 h，采用Supersignal孵育后曝光，通過Image lab軟件掃描后對條帶進行分析。目的蛋白條帶的光密度值與內參GAPDH條帶的光密度值相比，NF-κB p65條帶光密度值與內參Lamin相比，得到目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，正態分布計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，三組數據間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD方法;非正態分布計量資料采用秩和檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 殼寡糖對高脂飲食誘導肥胖小鼠體重、腎周及皮下脂肪組織的影響

與Control組比較，HF組小鼠體重、腎周脂肪和皮下脂肪組織重量均顯著升高（P < 0.01），HF+COS組小鼠體重明顯升高（P < 0.05）;與HF組比較，HF+COS組小鼠體重、腎周脂肪和皮下脂肪組織重量均顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。

2.2 殼寡糖對高脂飲食誘導肥胖小鼠脂肪細胞的影響

腎周和皮下脂肪組織HE染色提示，與Control組比較，HF組腎周及皮下脂肪組織中脂肪細胞體積均明顯增大（P < 0.05或P < 0.01），細胞大小非均一，出現較多冠狀結構;與HF組比較，HF+COS組腎周和皮下脂肪組織中脂肪細胞明顯變小（P < 0.05），冠狀結構減少。

2.3 殼寡糖對高脂飲食誘導肥胖小鼠血脂指標的影響

與Control組比較，HF組小鼠TC、TG、LDL-C以及FFA顯著升高，HDL-C顯著降低，HF+COS組LDL-C、FFA明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）;與HF組比較，HF+COS組TG、LDL-C、FFA均顯著降低，HDL-C顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05）;HF+COS組與HF組TC比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。

2.4 殼寡糖對高脂飲食誘導肥胖小鼠葡萄糖耐受和胰島素抵抗的影響

GTT試驗表明HF組小鼠空腹血糖高于Control組和HF+COS組，且達到峰值后下降速度減慢;HF組血糖AUC顯著高于Control組（P < 0.05），但與HF+COS組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。ITT試驗結果表明，HF組AUC高于Control組，差異有統計學意義（P < 0.05），胰島素注射后120 min，HF+COS組小鼠血糖水平較HF組略微上升，AUC下降，差異有統計學意義（P < 0.05）。

2.5 殼寡糖對高脂飲食誘導肥胖小鼠脂肪組織內質網應激相關分子表達的影響

與Control組比較，HF組小鼠的皮下脂肪組織GRP-78和PERK的mRNA及蛋白表達水平均明顯升高（P < 0.05或P < 0.01）;HF+COS組小鼠皮下脂肪組織GRP-78和PERK的mRNA及蛋白表達水平較HF組明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。

2.6 殼寡糖對高脂飲食誘導肥胖小鼠脂肪組織炎性因子釋放的影響

免疫組織化學法結果顯示脂肪組織中IL-6及TNF-α主要分布于細胞質中;免疫組織化學半定量分析結果及RT-PCR結果均顯示，與Control組比較，HF組小鼠皮下脂肪組織中IL-6及TNF-α表達明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）;HF+COS組小鼠皮下脂肪組織中IL-6及TNF-α表達明顯低于HF組（P < 0.05）。

2.7 殼寡糖對高脂飲食誘導肥胖小鼠脂肪細胞p-IκB、NF-κB p65蛋白表達的影響

Western blot結果顯示HF組脂肪組織p-IκB、NF-κB p65蛋白表達明顯高于Control組，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）;HF+COS組p-IκB及NF-κB p65表達較HF組降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。

3 討論

本研究通過對高脂飲食誘導的肥胖小鼠喂養殼寡糖，檢測肥胖小鼠血糖及血脂代謝水平以及ERS相關分子的變化，初步探討殼寡糖在緩解ERS、炎性因子釋放及胰島素抵抗中的作用及相關分子機制。結果顯示，高脂飲食喂養16周后，HF組小鼠血糖、血脂和體重均明顯增加，皮下組織脂肪細胞體積增加并伴炎癥細胞浸潤;HF+COS組血糖、血清TG、LDL-C和FFA與HF組相比明顯降低，體重、腎周及皮下脂肪組織重量均明顯降低，脂肪細胞體積減小，這也與以往動物實驗結果一致[12-13]。GTT及ITT結果顯示殼寡糖未能緩解肥胖誘導的小鼠葡萄糖耐受不良，但對胰島素敏感性減低卻有改善作用，這都提示殼寡糖具有一定程度的降血脂和改善胰島素抵抗的作用。

殼寡糖具有良好的水溶性，經口服途徑攝取后，在小腸上段快速地被上皮細胞吸收[14]，體外Caco-2單層細胞吸收模型驗證了殼寡糖輕易地穿越小腸上皮細胞[15]。由此推斷殼寡糖在吸收后經血液循環作用于脂肪組織、肝臟和骨骼肌等各個組織，影響葡萄糖和脂質的體內代謝[16]。

肥胖患者不僅血脂代謝紊亂，還長期處于慢性炎性狀態[12]。研究發現肥胖患者脂肪細胞可以分泌IL-6、TNF-α等促炎因子，影響全身代謝，導致胰島素抵抗[17]。ERS可能是連接肥胖、炎癥和代謝紊亂的核心機制：肥胖患者往往伴隨血脂代謝異常，而血脂代謝異常是ERS重要原因之一，大量研究發現肥胖患者內臟脂肪中ERS相關基因表達顯著高于正常體重人群[18];ERS在機體的炎性反應中也發揮著重要作用，參與多種炎癥性疾病的發生發展[19]。目前研究發現ERS有3條重要的下游通路：PERK、IRE1和ATF6，這3條通路均可以通過多種途徑影響炎性因子的釋放，而慢性炎性狀態與胰島素抵抗密不可分[19-20]。因此，尋找改善ERS的干預措施對預防和緩解肥胖患者胰島素抵抗有重要意義。本研究發現高脂飲食誘導肥胖小鼠皮下脂肪組織內質網應激蛋白GRP-78、PERK表達明顯增高，促炎因子IL-6、TNF-α表達增加，而殼寡糖能有效緩解肥胖狀態下脂肪組織ERS及炎性因子的釋放，因此飲食添加殼寡糖有望成為改善肥胖患者胰島素抵抗的有效措施。

NF-κB是重要的核轉錄因子，參與多種炎癥基因的轉錄調控，在炎性反應中發揮重要作用。目前大量研究證實，ERS的3條下游通路均能激活NF-κB，但機制各有不同[19-20]。在靜息狀態下，NF-κB與IκB形成復合物，以無活性形式存在于胞質中。當受到多種刺激時，IκB發生磷酸化并與NF-κB分離，無活性的NF-κB蛋白被激活，進而轉位至細胞核內，促進炎性因子的分泌和表達，引起胰島素抵抗。本研究發現，HF+COS組IκB磷酸化水平降低、NF-κB p65入核減少，炎性因子IL-6、TNF-α的生成減少。因此，殼寡糖可能通過緩解脂肪組織ERS，減少下游通路對NF-κB的激活，從而減少炎性因子的釋放，達到緩解胰島素抵抗的目的，但具體機制還有待進一步的研究。

綜上所述，殼寡糖能改善高脂飲食誘導的肥胖小鼠高血脂狀態，緩解脂肪細胞ERS，抑制炎性因子的釋放，并能在一定程度上抑制胰島素抵抗的發生，對代謝的紊亂具有改善作用，為殼寡糖生物活性研究提供了更全面的認知。

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（收稿日期：2018-03-09? 本文編輯：張瑜杰）