CRISPR家上新了：第三款CRISPR基因剪刀來襲

余惠敏

基因剪刀三兄弟

正如前面所說，CRISPR家有兄弟仨——三款基因剪刀，而其中的首款明星產品就是三兄弟之老大——CRISPR-Cas9，一經推出就成為學界爆款“剪刀”。

此前，科學家們在實驗室最常用的多功能基因組編輯工具就是CRISPR-Cas9，這是一種RNA 導向的核酸酶，可以切割DNA。

Cas9系統首先由美國加州大學伯克利分校Jennifer Doudna、瑞典于默奧大學Emmanuelle Charpentier和美國麻省理工學院- 哈佛大學博德研究所張鋒等實驗室在2012年和2013年報道。

這個C家老大有多火爆？

Cas9有效地實現了哺乳動物基因組的編輯，并帶動了基因編輯領域的迅猛發展，將基因編輯技術成功拓展到基因轉錄表達調控、表觀遺傳修飾、全基因組功能篩選、堿基編輯、基因組成像和細胞譜系追蹤等多種生物學應用。它能使基因組更有效地產生變化或突變，效率比既往基因編輯技術更高，讓CRISPR成為“生物科學領域的游戲規則改變者”，現已發展成為該領域最炙手可熱的研究工具之一。

而Cas9并非Cas蛋白家族中唯一一種RNA導向的核酸酶，除了它之外，研究人員還發現Cas12a和Cas12b也具備成為基因剪刀的潛力。

如今，Cas12a已被開發成基因組編輯工具，張鋒等人在2015年發現并改造的Cas12a（又稱為Cpf1）系統，能實現哺乳動物等多個物種的基因組編輯。

Cas9、Cas12a、Cas12b 三種核酸酶的位點圖和蛋白結構

這個老二比老大還優秀

Cas12a相對于Cas9來說有一些優勢：它比標準的Cas9要小，更容易進入組織和細胞;它剪切時離識別位點很遠，讓研究人員在編輯位置的選擇上有了更多的選擇。

于是，CRISPR基因剪刀的潛力者哥仨，就剩下Cas12b（又稱為C2c1）還沒被開發成功了！這種蛋白比Cas9或Cas12a更小，更容易通過病毒載體實現細胞間遞送，所以很可能是更好的基因剪刀。

特異性

目標特異性是指基因剪刀只瞄準那些為它們設定的目標基因，更高的特異性意味著更高的精確性，這對一款功能強大的基因編輯工具來說非常重要。

張鋒團隊的研究

為啥把有可能最棒的小弟剩下了？

因為Cas12b有嗜高溫的特性，很難開發成好用的基因編輯工具。Cas12b來自一種嗜酸耐熱菌，作為DNA裂解酶，它的最佳活性“工作環境”需要高達48℃的溫度。普通哺乳動物如果達到這種溫度，恐怕就要高燒死了吧！但達不到溫度要求，Cas12b的酶活性就不能發揮，會罷工喔！

張鋒團隊對Cas12b進行了研究，他們先在Cas12b蛋白家族中尋找到一種喜歡常溫的成員，鑒定出在37℃時能保持核酸酶活性的BhCas12b。但實驗發現，原始結構的野生型BhCas12b會切割雙鏈DNA中的非靶標單鏈，且溫度越低、錯誤越多，導致編輯效率較低。

為解決這一問題，張鋒團隊對Cas12b重新進行了設計，增強其在人體體溫37℃下的活性。根據蛋白質晶體結構的線索，研究人員通過4個點位突變，讓酶的活性點位更容易和DNA靶序列接近，得到重新設計的新款Cas12b。

與Cas9相比，重新設計的Cas12b在細胞培養實驗中對靶序列具有更高的特異性。畢竟，脫靶效應是CRISPR技術最大的隱患之一：Cas9酶有時會在靶點以外的地方進行切割，而這種切割有可能引起癌癥。

張鋒團隊在細胞培養實驗中，針對多個基因的多個靶序列，考察了新款基因剪刀的編輯效率。實驗結果顯示，新款Cas12b的編輯效率與Cas9、Cas12a相當，甚至更高;而且新款Cas12b導致的錯誤插入缺失比常用的Cas9少得多，脫靶率顯著降低。

李偉團隊的研究

不過，張鋒團隊的這款Cas12b基因剪刀還不能算首發。

不久前的2018年11月27日，《細胞發現》（Cell Discovery）發表了中國科學院動物研究所研究員李偉團隊的類似研究成果。該研究團隊通過系統挖掘，成功地鑒定出若干能在人體生理溫度工作的Cas12b（C2c1）酶。經過系統改造，有兩種Cas12b 酶被成功開發成為哺乳動物基因組編輯工具，能夠編輯人類細胞基因組并應用于制備動物疾病模型。他們開發的來自酸性脂環酸芽孢桿菌（AaCas12b）的Cas12b，可以在31℃～59 ℃溫度范圍內對哺乳動物基因組進行編輯。

那篇論文展示了該工具的三大優點：

一是Cas12b比應用最為廣泛的SpCas9和Cas12a更小，因此更容易用于需要載體遞送的臨床基因治療;

二是Cas12b能夠在寬廣的溫度范圍和pH范圍保持高的酶活性，有望適用于具有不同生理溫度的多個物種。同時與SpCas9相比，Cas12b核糖核酸酶（RNP）在人血漿中更穩定;三是Cas12b很難耐受向導RNA與靶DNA之間的堿基錯配，因此比SpCas9和Cas12a/Cpf1的脫靶效應更小，這意味著它在進行基因組編輯時更加安全。

針對這項新技術，該研究團隊已于論文發表一年前提交了專利申請，并已開始開發這項技術在基因治療中的應用。

當然，就像當初Cas9那款基因剪刀的打磨不是一個團隊完成的那樣，想要將Cas12b改造成和Cas9一樣應用廣泛的工具，也還有很多工作要做。但第三個潛在基因組編輯系統的出現，顯然將會帶給研究人員更多選擇。

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CRISPR 的專利大戰

此前，CRISPR基因編輯技術已經因其巨大的商業價值引發了專利大戰。其中最引人注目的是張鋒所在的博德研究所和Jennifer Doudna所在的加州大學伯克利分校之間的專利之爭，因為這兩家機構的專利范圍廣，對CRISPR-Cas9的大多數商業應用至關重要。

加州大學伯克利分校提出的專利是不限于任何環境的CRISPR-Cas9系統，博德研究所的專利主要為真核生物環境中的CRISPR-Cas9系統。美國專利商標局專利審判和上訴委員會曾于2017年2月作出關鍵裁決：麻省理工學院和哈佛大學的博德研究所的專利，與加州大學伯克利分校的發現并不“沖突”，博德研究所可以保留其在真核生物中使用CRISPR-Cas9的專利。之后，加州大學伯克利分校提起上訴，2018年9月聯邦巡回上訴法院維持判決，張鋒所在機構繼續占據上風。

值得一提的是，專利判決并不會影響CRISPRCas9技術在科研領域的應用。博德研究所方面稱，全世界的科研人員可以用他們的技術進行學術研究，但是廠商必須付費使用。