慢性自發性蕁麻疹患者外周血Th17 Trey及細胞因子水平變化的臨床意義

羅浩杰 楊建強 孫慧 朱文華 連煒煒

慢性自發性蕁麻疹（CSU）典型癥狀為皮膚瘙癢、 風團或紅斑，其病程一般＞6周，1周發病＞2次或每天發生，給患者日常生活、學習或工作帶來不良影響［1］。CSU發病機制尚未清楚，但較多文獻認為CSU發病多與自身免疫有關，特別是細胞免疫失衡［2-3］。CD4+T細胞被認為在CSU發生、進展中發揮關鍵作用，初始CD4+T細胞不僅有Th1、Th2細胞，且還能分化輔助性T細胞17（Th17）、調節性T細胞（Treg）。Th17主要分泌白介素-17（IL-17）、白介素-21（IL-21）等因子，近年來有研究表明Th17/Treg細胞失衡為自身免疫性疾病發病關鍵，但關于Th17、Treg細胞比例及其相關細胞因子與CSU的關系報道尚少。本文分析Th17、Treg細胞及相關細胞因子水平在CSU患者中的變化，為CSU臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年1月至12月本院就診的CSU患者120例。納入標準：（1）符合CSU相關診斷標準［4］；（2）就診前30d無免疫抑制劑、激素類藥物干預史；（3）就診前14d無組胺藥物干預史；（4）性別不限，年齡＞18歲；（5）均接受血清相關指標測定；（6）相關資料完整。排除標準：（1）妊娠期或哺乳期婦女；（2）肝腎功能不全；（3）合并其他系統性疾病；（4）急性自發性蕁麻疹；（5）資料不全者。其中活動期65例，靜止期55例。選擇同期性別、年齡相匹配的健康體檢者50例為對照組，均無自身免疫性疾病、感染及腫瘤。CSU疾病活動評估標準［5］以CSU皮膚瘙癢、風團發生情況為依據，采取5等級評分法，0分表示無，4分表示重度；0分判斷為靜止期，1～4分判斷為活動期。

1.2 方法 清晨空腹采集受檢者肘靜脈血6ml，按照要求規范處理后一部分用于Th17細胞、Treg細胞測定，另一部分用于血清細胞因子水平測定，均于本院實驗室完成。通過貝克曼庫爾特Gallios流式細胞儀測定Th17細胞、Treg細胞：（1）Th17細胞測定：肝素鋰抗凝，RPMI 1640稀釋，佛波酯4μl、離子霉素20μl、PMA 25μl滴入，37℃下孵育 240～360min。平均分成2管，分別加入CD3-PerCP 2.5μl、CD8-FITC 2.5μl，計為A管、B管，室內常溫下孵育15min，加入固定液Reagent A 100μl，室內常溫下放置15min；清晰后將溶血液Reagent B及破膜液加入這2管。之后A管內加入鼠IgGl-PE 2.5μl，B管內加入IL-17-PE 2.5μl，室內常溫下放置15min，再次清晰，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）0.5ml重懸，流式細胞儀測定。（2）Treg細胞測定：Ficoll淋巴細胞分離液順利獲取外周血單個核細胞（PBMCs），不完全1640培養基洗滌2次，之后完全1640培養基（含有1%胎牛血清）重懸細胞，調節細胞濃度為1×106/ml，C4-FITC、CD25-PC5抗體10μl一起加入，4℃下孵育20min，PBS洗滌，加入固定/穿膜液400μl，室內常規溫下放置40min，PBS再次洗滌，加入緩沖液800μl，室內常溫下放置20min。重懸后均平均成2管，分別加入Foxp3-PE抗體、同型對照抗體，室溫下孵育30min，PBS洗滌，PBS重懸，流式細胞儀測定。應用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血清白介素-17（IL-17）、白介素-21（IL-21）、轉化生長因子-β（TGF-β）水平，試劑盒購自上海潤裕生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。計數資料以%表示，用χ2檢驗，計量資料以（x±s）表示，多組間行單因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗；Spearman相關性分析血清指標與癥狀評分的相關性，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組一般資料比較 見表1。

表1 各組一般資料比較（x±s）

2.2 各組Th17、Treg細胞比例 見表2。

表2 各組外周血Th17、Treg細胞比例比較［%，（x±s）］

2.3 各組血清細胞因子變化 見表3。

表3 各組血清IL-17、IL-21、IL-35水平比較［ng/L，（x±s）］

2.4 相關性分析 Spearman相關性分析顯示血清IL-17、IL-21水平與CSU癥狀評分呈正相關（P＜0.05），而TGF-β水平與CSU癥狀評分無相關（P＞0.05）。見表4。

表4 CSU癥狀評分與血清指標的相關性

3 討論

CSU發病機制無明確定論，免疫球蛋白E結合于相應受體造成肥大細胞脫顆粒，促使組胺大量分泌釋放，最終造成蕁麻疹發生［6］。近年來發現T細胞亞群及對應因子異常在CSU發病、進展中發揮重要作用［7-8］。

Th17作為CD4+T細胞新型促炎細胞之一，起初在TGF-β作用下對RORγ表達，TGF-β、白介素-6（IL-6）共同影響，促進Th17β細胞分化，IL-21產生，經由自分泌對Th17深入分化、擴增。IL-17在Th17細胞中占據重要地位，包括IL-17A、IL-17F等指標。CD4+T細胞、巨噬細胞等多個細胞均可促IL-17產生，其中發揮主導作用的是CD4+T細胞［9］。IL-17除誘導IL-6等促炎因子產生、釋放外，還能誘導人類B細胞分化，致使異常抗體產生，參與自身免疫反應。有研究表明Th17細胞經由分泌產生IL-17、IL-21等相關細胞因子，參與相關自身免疫性疾病、炎癥反應過程［10］。石教啟等［11］研究發現相比健康體檢人員，急性蕁麻疹患者血清IL-6、IL-17、TGF-β及轉錄因子維甲酸相關孤兒素受體γt（RORγt）mRNA水平均顯著高。認為Th17細胞可能對IL-6、IL-17等促炎因子分泌以參與急性蕁麻疹發病。Atwa等［12］發現CSU患者血清IL-17、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-23（IL-23）水平比健康人員顯著高，且活動程度與上述血清因子正相關。本資料結果顯示CSU活動期外周血Th17細胞比例、血清IL-17、IL-21水平比CSU靜止期、對照組均顯著高，而活動期與靜止期比較無顯著差異。提示Th17細胞及其相關因子IL-17、IL-21可能促CSU發生。同時本資料顯示，血清IL-17、IL-21水平與癥狀評分呈正相關。認為血清IL-17、IL-21可作為CSU疾病活動評估有效指標。

Treg細胞也是CD4+T細胞亞群之一，于體內外對CD4+T、CD8+細胞增殖負性調節，對細胞免疫功能造成不同程度的影響，其表達與CSU發病有關［13］。TGF-β為小分子蛋白，有激素樣活性特點，其分泌與Treg細胞密切相關，可促Treg細胞生成。TGF-β能經由自身調節作用對炎癥反應影響，炎癥剛開始時或TGF-β1含量不多時可將免疫激活，加重炎癥反應，TGF-β1水平較高時則對相關炎癥細胞分化抑制，阻斷或減少炎癥因子分泌產生，發揮免疫抑制作用。TGF-β被認為是Th17和Trg細胞連接的關鍵。本資料結果顯示相比健康者、CSU靜止期，CSU活動期外周血Treg細胞比例、血清TGF-β水平均顯著低。提示CSU活動期Treg細胞比例、血清TGF-β水平降低，可能加重炎癥反應。這可能與TGF-β1促Treg細胞分化作用有關，白介素-2（IL-2，與Treg細胞發育、擴增有關）表達高，提高TGF-β1誘導之特異性轉錄因子叉狀頭轉錄因子（Foxp3）表達，促Treg細胞，且對RORγt表達抑制，進而抑制Th17細胞分化［14］。關于TGF-β水平表達與石教啟等［11］研究結果相反，這因TGF-β有雙重作用，一方面高表達促IL-17分泌，誘導Th17細胞分化，另一方面高表達促Treg細胞表達。為此關于Th17、Treg細胞之間平衡與否及其兩者失衡可否解釋CSU發病機制仍需進一步研究。