不同濃度枸杞多糖對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織TGF-β1的影響

摘要：目的：探究不同濃度枸杞多糖（Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP）對腎上皮細(xì)胞間質(zhì)腎纖維化時TGF-β1表達(dá)的影響，探討與分析其對腎纖維化的保護(hù)機(jī)制。方法：通過單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)（UUO）對40只12周齡雄性大鼠建立腎間質(zhì)纖維化模型，將其隨機(jī)分為LBP高劑量（800mg/kg）組、中劑量組（650mg/kg）、低劑量組（450mg/kg）和實(shí)驗(yàn)組，每組各10只。實(shí)驗(yàn)組采用LBP（空白組用生理鹽水）連續(xù)灌胃三周。取左腎切片應(yīng)用HE染色法和Masson三色染色觀察組織學(xué)變化，取血清用免疫組化法檢測各組TGF-β1分布水平。結(jié)果：1.實(shí)驗(yàn)組腎間質(zhì)中炎性浸潤及腎小管損傷明顯，造模成功。2.顯示TGF-β1在各腎組織中與對照組相比均下降，以實(shí)驗(yàn)組中高劑量組明顯。結(jié)論：LBP能夠降低大鼠血清中TGF-β1的水平，且一定范圍內(nèi)較高者濃度表現(xiàn)明顯，故推測LPB可能由此抑制腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展，對腎纖維化起一定保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：枸杞多糖;腎間質(zhì)纖維化;TGF-β1

枸杞的主要有效成分為枸杞多糖，其主要功效為滋補(bǔ)肝腎、益精明日^[1]，在臨床中主要用于腎虛所致的衰老、生殖功能障礙以及機(jī)體免疫力低下^[2]。研究證表明LBP還可通過改善腎微循環(huán)延緩腎臟衰老改善腎結(jié)構(gòu)，能顯著改善衰老腎臟血液循環(huán)和腎組織形態(tài)，對腎臟具有保護(hù)作用^[3]。枸杞多糖在臨床中預(yù)防和治療慢性腎臟病有重大意義。

近年來慢性腎臟病的發(fā)病率越來越高，普遍認(rèn)為腎間質(zhì)細(xì)胞的纖維化造成的腎臟實(shí)質(zhì)性損傷是導(dǎo)致慢性腎臟病的常見治病因素。Lan等^[4]表明TGF-β1是導(dǎo)致進(jìn)展性腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵通路。有研究表明，TGF-β1可誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞激活并導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)生成，進(jìn)而導(dǎo)致腎纖維化和腎小管萎縮^[5]。同時TGF-β1蛋白可以直接激活一些間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因如波形蛋白、纖連蛋白和膠原蛋白的表達(dá)^[6～7]。TGF-β1、smad蛋白介導(dǎo)腎上皮間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展，調(diào)控腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程^[8]，導(dǎo)致腎纖維化引起慢性腎疾病。

1材料與方法

1.1動物處理及標(biāo)本制作

選取SPF12周雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為一個對照組和三個實(shí)驗(yàn)組，每組各10只;實(shí)驗(yàn)組高劑量組每天灌胃枸杞多糖800mg/kg/d、中劑量組每天灌胃枸杞多糖650mg/kg/d、低劑量組每天灌胃枸杞多糖450mg/kg/d，對照組灌胃0.9%的生理鹽水，維持21d，收集各組大鼠血清取及對各組大鼠左側(cè)腎臟切片。

1.2 HE染色和Masson三色染色形態(tài)學(xué)觀察

取大鼠左側(cè)腎臟進(jìn)行石蠟標(biāo)的本制作：腎臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后沖洗，再常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋。

1.3血清中TGF-β1的測定

用TGF-β1檢測試劑盒用于定量檢測血清中TGF-β1的含量，取血清離心20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分），收集上清液，每只大鼠血清做5張涂片，在40 倍物鏡下隨機(jī)取10 個不同視野，用Motic Images Advanced 3.2 圖像分析系統(tǒng)，測定TGF-β1蛋白陽性反應(yīng)物相對含量的平均光密度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ± s）表示，用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后進(jìn)行方差分析，Plt;0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1組織學(xué)觀察

對照組、實(shí)驗(yàn)低劑量組和中劑量組腎小管明顯擴(kuò)張，部分萎縮，間質(zhì)基質(zhì)沉淀，實(shí)驗(yàn)高劑量組腎小管稍有擴(kuò)張，部分萎縮，間質(zhì)基質(zhì)可見少許沉淀。

2.2血清中TGF-β1測定結(jié)果

高中低劑量組中大鼠血清TGF-β1在對照組中均呈陽性反應(yīng)，尤其以高劑量組為強(qiáng)陽性反應(yīng)（Plt;0.05），將其進(jìn)行平均光密度統(tǒng)計分析，具體見表1。

表1大鼠血清TGF-β1陽性反應(yīng)的平均光密度（x ± s）

*高劑量組與對照組中其他細(xì)胞比較，Plt;0.05

3討論

目前隨著慢性腎病的發(fā)病率越來越高，研究者對腎纖維化的保護(hù)處于熱門討論話題。腎纖維化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與多種治病因素有關(guān)，作為腎小管纖維化的關(guān)鍵通道TGF-β1，其能誘導(dǎo)細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的大量堆積形成腎間質(zhì)纖維化，最終引起慢性腎衰竭^[9-10]。本次研究通過單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立腎纖維化模型，用HE染色法和Masson三色染色常規(guī)觀察LBP干預(yù)后腎臟組織的變化，通過對各組檢測TGF-β1的表達(dá)進(jìn)行檢測分析.每組均相應(yīng)的有所下降，尤其以高濃度組為較明顯;而從組織學(xué)觀察來看，高濃度組的腎纖維化相比其他組有明顯減輕。故此可推測，LBP在干預(yù)腎纖維化對其起到保護(hù)作用時，很可能是通過對TGF-β1的表達(dá)從來對其起到保護(hù)作用。

綜上所述，LBP能減輕UUO模型對大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響，其中LBP高劑量的作用效果優(yōu)于LBP低、中劑量組，且在TGF-β1的陽性表現(xiàn)來看，高濃度組的陽性反應(yīng)較為強(qiáng)，LBP可調(diào)控TGF-β1蛋白在上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用，緩解腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，從而為臨床預(yù)防和治療慢性腎臟病提供新的科學(xué)參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1].南亞昀，雍學(xué)芳 枸杞多糖藥理學(xué)研究進(jìn)展 天津中醫(yī)藥 2014年12月第31卷第12期

[2].馬倩倩 枸杞多糖生物活性的研究進(jìn)展 農(nóng)產(chǎn)品加工 2017年7月第七期

[3].劉曉梅 陳 尚 枸杞多糖對衰老小鼠腎小球形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響 中國老年學(xué)雜志 2009;18;2354-2355

[4]. Lan HY，Mu W，Tomita N，et a1.Inhibition of renal fibrosis by gene transfer of inducible Smad7 using ultrasound—mi— crobubble system in rat UUo model.J Am Soc Nephr01. 2003，14（6）：1535—1548.

[5]. Meran S，Steadman R.Fibrobla st s and myofibroblast S in renal fibrosiS[J].Int J Exp Path01，2011，92（1 58）：67

[6]. Heldin C H，M oustakas A.Role ofSmads in TGFbeta signaling [J].CellTissueRes，2011，347（ 1）：21- 36.

[7].ShinJA，HongOK，LeeHJ，etal.Transforming growth factor-β inducese pithelialtomesenchymaltransition and suppresses the proliferation and transdifferentiation ofcultured human pancreatic ductcells[J].JCellBiochem，2011，112（ 1）： 179- 88.

[8] KaIman JM，Kumar S，Sander P.Markers of c01lagen syn-thesis，atrial fibrosis，and the mechanisms undedying atrial fibrillation[J].J Am c01l Cardi01，2012，60（18）：1807-1808.

[9]Loeffler I，Wolf G.Transforming growth factor-β and the progression of renal disease[J].Nephrol Dial Transplant，2014，29（Suppl 1）：i37-i45

[10]Meng XM，Tang PM，Li J，et al.TGF-β1/smad signaling in renal fibrosis[J].Front Physiol，2015，6：82