正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化白花蛇舌草中三萜類成分的提取工藝

陳麗娜，劉春明，楊曉靜

(長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130032)

白花蛇舌草(Hedyotisdiffusa)，系茜草科耳草屬植物[1]。別名蛇舌草、蛇利草、蛇總管、鶴舌草、龍舌草等。常以全草供藥用，具有清熱解毒、消癰、利濕通淋的功效，常用于治療各種腫瘤及炎癥[2]。藥理研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草中三萜類化合物作為其中的活性成分之一，具有抗腫瘤、抗菌、護(hù)肝、免疫調(diào)節(jié)等方面的活性[3]。關(guān)于白花蛇舌草中三萜類化合物的提取工藝的研究尤為重要。謝艷、丁博等[4-5]采用溶劑回流提取法粗提并結(jié)合有機(jī)溶劑萃取，初步提取并測(cè)定了白花蛇舌草中的三萜類化合物的含量，該方法提取時(shí)間長(zhǎng)，溶劑耗費(fèi)多且在萃取時(shí)涉及有毒的有機(jī)溶劑。陸慧等[6]通過正交試驗(yàn)對(duì)白花蛇舌草中的三萜類化合物的超臨界CO2萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化，萃取率雖然較前者有所提高，但耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。張才華等[7]利用索氏提取方法提取了白花蛇舌草中兩種三萜類成分——齊墩果酸和熊果酸，該方法以氯仿為溶劑，耗費(fèi)8 h，同樣存在耗時(shí)長(zhǎng)、有機(jī)溶劑使用量大的問題。

1995年，Richter等[8]提出了一種全新的萃取方法——加速溶劑萃取法(Accelerated Solvent Extraction, ASE)。該方法是通過提高溫度和增加壓力來進(jìn)行有機(jī)溶劑的自動(dòng)萃取，具有有機(jī)溶劑用量少、萃取快速、樣品回收率高等突出優(yōu)點(diǎn)，被美國(guó)環(huán)保局(EPA)推薦為標(biāo)準(zhǔn)方法[9]。

本文首次引入加速溶劑萃取法(ASE)提取白花蛇舌草中的三萜類化合物，通過正交試驗(yàn)并結(jié)合簡(jiǎn)單可行的紫外分光光度法定量，最終得到加速溶劑提取的最佳提取工藝。在提高提取率的基礎(chǔ)上，節(jié)省了大量的溶劑和時(shí)間，通過重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了此方法的穩(wěn)定性和可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

加速溶劑萃取裝置(戴安中國(guó)有限公司，ASE-150)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)，Heidolph)；紫外分光光度計(jì)(日本島津有限公司，UV-2450)。

1.2 試劑

白花蛇舌草(河北保定同仁堂，長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室王晶鑒定)；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.5%,購(gòu)自aladin)；無水乙醇(分析純，購(gòu)自北京化工廠：配置成不同體積分?jǐn)?shù)待用)；甲醇(色譜級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水(LaboStarTMTWT UV7，美國(guó)SIEMENS公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總?cè)频臏y(cè)定

以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，利用紫外分光光度法測(cè)定總?cè)坪浚瑴y(cè)定波長(zhǎng)為203 nm。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取齊墩果酸對(duì)照品10.0 mg置于10 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶解后，用甲醇定容至刻度，搖勻，既得(每毫升含齊墩果酸對(duì)照品1.0 mg)。

1.3.3 供試品溶液的制備

精密稱取白花蛇舌草粉末2.0 g置于ASE提取釜中，以ASE法進(jìn)行提取。提取溶劑為90%的乙醇，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為10 min，提取次數(shù)為3次。合并提取液，減壓濃縮至干，用4 mL甲醇溶解，稀釋1000倍，待測(cè)。

1.3.4 方法學(xué)研究

取上述齊墩果酸對(duì)照品溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋，制備齊墩果酸質(zhì)量濃度分別為0.004、0.008、0.010、0.015、0.020、0.030、0.040 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取濃度為0.030 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定齊墩果酸的最大吸收波長(zhǎng)為203 nm。在最大吸收波長(zhǎng)處分別測(cè)定上述標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，以質(zhì)量濃度X(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，吸光度Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，制備齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取濃度為0.020 mg·mL-1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)3次測(cè)定吸光度值，考察方法的精密度。分別準(zhǔn)確稱取同一批次白花蛇舌草藥材粉末3份，按1.3.3方法制備并測(cè)定其總?cè)坪浚疾旆椒ǖ闹貜?fù)性。取同一供試品溶液，在一天內(nèi)，每隔4 h測(cè)定一次吸光度值，考察方法的穩(wěn)定性。

1.3.5 提取工藝研究

選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)及提取次數(shù)(D)這4個(gè)因素為考察因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，以L9(34)正交設(shè)計(jì)表安排實(shí)驗(yàn)，以總?cè)频暮繛樵u(píng)價(jià)指標(biāo)。因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.6 總?cè)坪康挠?jì)算

按照公式(1)對(duì)白花蛇舌草提取物中總?cè)坪窟M(jìn)行測(cè)定。

(1)

其中，A為供試品溶液的吸光度；本實(shí)驗(yàn)稀釋倍數(shù)為4000倍；粗粉質(zhì)量均為2.0 g。

2 結(jié)果與討論

2.1 總?cè)坪康臏y(cè)定

齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，相關(guān)系數(shù)R為0.9982，表明線性關(guān)系良好。精密度實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.16%(n=3)，表明儀器精密度良好。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.98%(n=3)，表明方法的重現(xiàn)性良好。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的RSD為0.36%(n=6)，表明供試品溶液中總?cè)频暮吭?4 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

圖1 齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取工藝研究

分別精密稱取白花蛇舌草粉末2.0 g，按正交表的設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用紫外分光光度法測(cè)定三萜類化合物的含量，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2和表3。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果分析表

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

方差分析結(jié)果表明，應(yīng)用加速溶劑萃取法提取三萜類化合物時(shí)，提取效率的影響因素大小順序依次為：提取溫度>提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取次數(shù)。由正交實(shí)驗(yàn)表可以看出，最佳提取工藝組合為A2B2C3D1，即提取溫度為80℃，提取時(shí)間為15 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%，提取次數(shù)為1次。

2.3 總?cè)频奶崛÷?/h3>

根據(jù)2.2所確定的最佳提取工藝，對(duì)白花蛇舌草中總?cè)七M(jìn)行提取，按公式(1)進(jìn)行計(jì)算。2.0 g白花蛇舌草中三萜類化合物的提取量為112.77 mg·g-1，提取率為11.3%。

3 結(jié)論

本文通過正交試驗(yàn)研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)加速溶劑萃取法提取白花蛇舌草中三萜類化合物提取率的影響。結(jié)果表明，各因素的影響順序依次為：提取溫度>提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取次數(shù)，最佳提取工藝組合為：提取溫度為80℃，提取時(shí)間為15 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%，提取次數(shù)為1次。在此條件下，白花蛇舌草中三萜類化合物的提取率達(dá)11.3%(w/w)。加速溶劑萃取—紫外分光光度法聯(lián)用技術(shù)可以用于快速分析白花蛇舌草中總?cè)祁惢衔锖俊Ｅc其它提取方法相比，此方法提取率高，操作簡(jiǎn)便快捷,節(jié)省溶劑且穩(wěn)定性好，是應(yīng)用前景較好的提取方法之一。