動物源性皮膚癬菌病32例患者病原菌體外藥敏試驗

陳玉娟，熊心猜，張 浩，唐芹芹

動物源性皮膚癬菌病是由皮膚癬菌感染引起的人獸共患疾病，治療皮膚癬菌病的藥物主要為非多烯類、唑類、丙烯胺類等藥物，各種菌對藥物的敏感性不同。本試驗對已收集并經鑒定確診為動物源性皮膚癬菌病的皮膚癬菌[1]為目標株，參照美國臨床實驗室標準化研究所（CLSI）M38-A2方案[2]，選擇灰黃霉素（GRI）、伊曲康唑（ICZ）、特比萘芬（TBF）、氟康唑（FCZ）為實驗藥物，對分離的皮膚癬菌進行抗真菌藥物敏感性實驗，觀察其對臨床常見抗真菌藥物的敏感性，為臨床選藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 收集2013年10月—2014年11月就診于川北醫學院附屬醫院皮膚科的患者，有明確動物接觸史，經鑒定人與動物由同一種皮膚癬菌致病，確診為動物源性皮膚癬菌病32例患者的菌株。經形態學、生理生化學，并以微衛星序列（GACA）4、NTS1、NTS2為引物行分子生物學方法鑒定，共分離出3種皮膚癬菌，包括21株犬小孢子菌、6株須癬毛癬菌復合體和5株石膏樣小孢子菌。

1.1.2 藥物 GRI（東京化工業株式會社，批號：QR3KJ-JK，純度＞97.0%）；ICZ（東京化工業株式會社，批號：IRNNI-CR，純度＞98.0%）；FCZ（東京化工業株式會社，批號：QAGTF-LQ，純度＞98.0%）；TBF（美侖生物技術有限公司，批號：S1101A，純度＞98.5%）。FCZ是水溶性藥物，在無菌操作下用滅菌蒸餾水溶解，藥物濃度的范圍配成0.125 0 ～ 64.000 0 μg/ml；GRI、ICZ、TBF 是 脂 溶性藥物，溶于100%的二甲基亞砜（DMSO），藥物濃度的范圍為 ：GRI與 ICZ 0.031 3 ～ 16.000 0 μg/ml，TBF 0.001 0～0.500 0 μg/ml。且DMSO的最終濃度不能超過1%，以免抑制真菌活性。

1.1.3 主要試劑與儀器 沙堡葡萄糖瓊脂培養基（SDA培養基）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA培養基）、RPMI 1640（含谷氨酰胺，不含酚紅）、DMSO、3-（N-嗎啉）丙磺酸（MOPS）、聚山梨酸20、氫氧化鈉（NaOH）。96孔培養板（U型底）、血細胞計數板、放大鏡、超凈工作臺（AIRTECH,JPN），電熱恒溫培養箱（重慶永恒實驗儀器廠）、光學顯微鏡（Olympus company，JPN）。

1.1.4 質控菌株 須癬毛癬菌復合體 ATCC-4439和紅色毛癬菌 ATCC-4438，購自中國醫學科學院皮膚病研究所真菌菌種保藏管理中心。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 取質控菌株和已純化的目標菌株，轉種于SDA培養基上培養7 d活化真菌。將已活化菌株接種于PDA培養基上，28℃培養7 d。采用M38-A2方案[2]及相關文獻[3,4]的方案制備菌懸液，將2 ml含有0.1%聚山梨酸20的0.85%無菌鹽水覆蓋菌落，用無菌試紙輕刮菌落表面使孢子脫落，反復多次抽吸液體制成菌懸液，將菌懸液移至一次性無菌塑料試管中，置振蕩器上振蕩5 min，靜置10 min。用加樣槍吸取1 ml上層均質液體至無菌試管中，調整菌懸液濃度為（2～3）×105CFU/ml，即比濁儀的濁度為0.2～0.3麥氏單位[5]，并用血細胞計數板驗證計數。質控菌株采用上述方法制備菌懸液。取部分已制備好的菌懸液20 μl，用滅菌蒸餾水稀釋25倍后取100 μl均勻涂布于SDA培養皿上，28℃培養3～5 d后，計數培養皿上菌落的數量，以獲取準確的菌懸液濃度。

1.2.2 96孔藥敏板的制備及培養 采用M38-A2方案[2]及文獻[3,4]推薦的微量液基稀釋法制備96孔藥敏板（圖1）。將4種藥物的儲備液取出融化后，用RPMI 1640液體培養基將藥物濃度稀釋成藥敏板首孔終濃度的 2 倍，即 GRI 32 μg/ml，ICZ 32 μg/ml，TBF 1 μg/ml，FCZ 128 μg/ml。用 96 孔板進行實驗，首先在1～11孔中各加入100 μl RPMI 1640培養基，第12孔加200 μl RPMI 1640培養基；以GRI為例，在首孔內加入32 μg/ml 的工作液100 μl，混勻，此時首孔藥物濃度為16 μg/ml，從中吸取100 μl加入第2孔，混勻后第2孔的濃度為8 μg/ml，以此類推稀釋至第10孔時，將最后的100 μl液體棄去。第11孔為生長對照（陽性對照），不加藥物稀釋液，第12孔為空白對照（陰性對照）。在第1～11孔中各加入100 μl菌懸液，此時1～12孔內均含有200 μl的液體。將已接種完成的96孔藥敏板放置28℃恒溫箱中靜置孵育培養，96 h后讀取最低抑菌濃度（MIC）值。每次試驗均包括質控菌株。

1.2.3 微量稀釋法MIC值判讀 根據CLSI M38-A2方案的標準，在自然光充足的條件下，借助閱讀鏡輔助肉眼判讀MIC值。將加有GRI、ICZ、TBF、FCZ的孔中菌落生長情況與生長對照相比，肉眼觀察出現80%或更多生長抑制作為判讀MIC值的標準。為保證結果的準確性，本實驗結果均由2人共同判讀MIC值。每株標本重復做2次實驗。

圖1 倍比稀釋法制備96孔藥敏板制備圖

1.2.4 質控 實驗過程中盡量排除可能影響實驗的因素，比如新配制的RPMI 1640培養基、抗真菌藥物的批號更換、新制備的96孔藥敏板以及實驗器皿的更換等，均應進行質量控制，以確保體外抗真菌藥敏試驗過程的精確性和準確性，嚴格監測實驗中的溫度、濕度及儀器的使用狀況，操作時嚴格按操作要求進行。每次操作過程均設質控菌株。

1.3 統計學方法

所有數據采用SPSS13.0統計軟件進行統計，抗真菌藥物之間的MIC值進行Kruskal-Wallis秩和檢驗，不同菌種的兩兩比較采用S-N-K法。P＜0.01認為差異有統計學意義。

2 結果

經過96 h培養后觀察，GRI、ICZ、TBF、FCZ 4 種藥物敏感試驗的MIC范圍見表1，MIC50值及MIC90值見表2。4種抗真菌藥物對犬小孢子菌的藥敏試驗MIC90：GRI為2.000 0 μg/ml，ICZ 為 0.500 0 μg/ml，TBF 為 0.015 6 μg/ml，FCZ 為16.000 0 μg/ml。4種抗真菌藥物對須癬毛癬菌復合體的藥敏試驗 MIC90：GRI為 1.000 0 μg/ml，ICZ 為0.500 0 μg/ml，TBF 為 0.062 5 μg/ml，FCZ 為 32.000 0 μg/ml。4種抗真菌藥物對石膏樣小孢子菌的藥敏試驗MIC90：GRI 為 2.000 0 μg/ml，ICZ 為 1.000 0 μg/ml，TBF 為 0.062 5 μg/ml，FCZ 為 16.000 0 μg/ml。

4種不同抗真菌藥物對犬小孢子菌、須癬毛癬菌復合體和石膏樣小孢子菌的MIC值經Kruskal-Wallis秩和檢驗（P＜0.01），差異有統計學意義（表3）。采用S-N-K法對不同菌種兩兩比較可知，4種藥物對犬小孢子菌和須癬毛癬菌復合體的藥敏試驗 MIC 值平均秩次為：TBF＜ICZ＜GRI＜FCZ，4種藥物對石膏樣小孢子菌的藥敏試驗MIC值平均秩次為 ：TBF＜ICZ/GRI＜FCZ。以 3 種皮膚癬菌為總體進行Kruskal-Wallis秩和檢驗和S-N-K法檢驗，4種藥物對皮膚癬菌的MIC值差異有統計學意義（P＜0.01），其藥敏試驗MIC值的平均秩次為：TBF＜ICZ＜GRI＜FCZ。

3 討論

2008年美國CLSI在產孢絲狀真菌M38-A藥敏試驗方案的基礎上提出了M38-A2方案[2]，試驗方法的標準化使皮膚癬菌抗真菌藥敏試驗結果可靠。

表1 皮膚癬菌的MIC值 （μg/ml）

表2 皮膚癬菌的MIC50值及MIC90值 （μg/ml）

菌 株 GRI ICZ TBF FCZ P值M. canis 51.79 33.93 11.10 73.19 0.000 T. mentagrophytes 14.17 10.33 4.00 21.50 0.000 N. gypsea 10.40 10.30 3.60 17.70 0.002 Tot 75.28 54.13 17.27 111.39 0.000

GRI在1958年開始用于臨床，應用時間長，是20世紀末治療頭癬的主要用藥。隨著科學的發展，ICZ和TBF已成為目前治療皮膚癬菌病最常用的口服抗真菌藥。本實驗對GRI、ICZ、TBF和FCZ 4種藥物的MIC值比較顯示，4種不同抗真菌藥物對犬小孢子菌、須癬毛癬菌復合體和石膏樣小孢子菌的MIC值差異有統計學意義。4種藥物對犬小孢子菌和須癬毛癬菌復合體的抗真菌效果依次為TBF＜ICZ＜GRI＜FCZ；4種藥物對石膏樣小孢子菌的抗真菌效果依次為：TBF＜ICZ/GRI＜FCZ。以3種皮膚癬菌為總體分析可見，4種藥物對皮膚癬菌的抗真菌效果依次為 TBF＜ICZ＜GRI＜FCZ。以特比萘芬的抗真菌效果最好，MIC90為0.0625 μg/ml，MIC值范圍為 0.001 0 ～ 0.062 5 μg/ml，其次為 ICZ 和 GRI，FCZ的抗真菌效果較差，與Silvat等[6]和Ansari 等[7]報道的結果基本相同。實驗證明，早期正確的抗真菌治療直接影響患者的預后[8]，該結果可對本地區皮膚癬菌病患者的臨床治療提供選藥參考。

本實驗結果與Ansari等[7]進行的一項研究結果不完全一致，可能是由于菌種的地區差異，對抗真菌藥物的敏感性不同，或實驗室間方法及操作差異的結果。本試驗缺乏皮膚癬菌抗真菌藥物的體內試驗及對MIC值與臨床患者治療效果之間的相關性分析，有待進一步研究。

Gupta等[9]提出了關于現有藥物的新配方及藥物創新的見解。Lopes等[10]介紹了各種植物衍生物及其活性成分抗皮膚癬菌的作用機制。國內研究發現，生物堿類、酚類、黃酮類中藥單體具有抗真菌活性，且與目前臨床應用的抗真菌藥物有協同作用[11]。人口的流動、人類生活方式的改變及抗真菌藥物的應用不斷推動著皮膚癬菌的進化[12]，是否可以找到尚未開發的化學成分的新藥是目前面臨的問題。