金納米粒子用于小鼠乳腺癌光聲成像研究

祖蒞惠，代一猛，胡真真，韓亮，劉景鑫

1. 吉林大學中日聯誼醫院 放射線科，吉林 長春 130021；2. 吉林大學中日聯誼醫院 病理科，吉林 長春 130021

引言

乳腺癌是女性排名第一的常見惡性腫瘤。目前乳腺癌的主要影像學檢查方法是鉬靶、超聲和MR[1]。上述檢查方法的應用都存在一定的局限性，如鉬靶的假陽性率和假陰性率較高，超聲診斷依賴于操作者的診斷水平，MR檢查費用較高，且在乳腺癌診斷上的應用價值也備受爭議[2]。因此急需一種診斷準確、操作簡單、成本低廉的檢查技術手段。光聲成像（Photoacoustic imaging，PA）一種新興的成像模式，近來引起廣泛關注。它的成像原理是短波長幅度調制式或脈沖式激光脈照射生物組織后，部分光能被吸收轉變為熱能，由于熱脹冷縮效應激發產生聲波[3]。PA成像將光學成像和超聲成像相結合，具有無侵襲性、易操作、高分辨率、高對比度等優勢，是未來生物醫學領域重要的實時成像技術之一[4]。

在過去幾年里，金屬納米結構（如Au、Cu和Pd）在催化、光子學及生物領域引起廣泛關注，由此在生物傳感、藥物傳遞、腫瘤治療和分子成像等方面產生大量研究。Au納米星由于具有可調的等表面離子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）吸收帶、較大的吸收-閃射比和摩爾消光系數，可能更適用于PA成像或光熱治療研究[5-6]。不同形態的金納米粒子（如殼、棒狀、星狀和納米籠）被用于光熱治療或PA成像研究。這些納米材料具有低光漂白、可調諧SPR特性、在近紅外區域強吸收、光熱轉換效率高等優點[7]。其中，金納米殼在早期臨床研究中被用于頭、頸部和前列腺腫瘤的光熱治療。但是，金納米殼的合成過程較為復雜，金納米殼在一定時間內很難排出體外，因此限制了其進一步應用[8]。金納米棒不穩定，在NIR光照射下容易融化[9]。金納米星的合成方法簡單，具有大吸收截面和高吸收散射比，被認為是較為理想的PA成像材料[5-6]。

一般情況下，合成金納米材料需要使用十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）。CTAB具有很強的毒性，且很難用PEG置換[9]。本研究中我們使用牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）對納米粒子行表面包覆。BSA是天然存在的蛋白質，可用于還原和穩定納米材料[10-11]；BSA含有豐富的官能團，如羧基、氨基和巰基，是較為理想的表面包覆劑。用其合成的納米粒子具有很好的生物相容性、膠體穩定性，容易進行表面修飾，而且合成方法簡單[12-13]。

本研究中，我們將以一種綠色的金種子生長方法制備金納米星，選擇的表征策略包括TEM、DLS、FTIR、UV-vis-NIR吸收波譜等。細胞毒性實驗和不同組織病理切片用于評價其生物毒性。最后，本研究建立4T1乳腺癌模型，探索了給藥后腫瘤組織PA成像特點。

1 材料與方法

1.1 PA成像系統

Endra Nexus 128 PA斷層掃描系統（Endra Nexus128 PA Tomography System）用于成像。該系統配備了可調節的納秒脈沖激光器（20 Hz，7 ns脈沖，波長680～950 nm）；128個非聚焦超聲探頭（5 MHz中心頻率，3 mm直徑）排列成半球形，掃描時內部盛滿38℃蒸餾水；一個碗狀中央含凸起的托盤置于其上方，用于固定成像部位，見圖1。Osirix（OsiriX Foundation, Genève，Switzerland）軟件（開放性軟件）用于數據處理和圖像重建。

圖1 PA成像系統示意圖

1.2 金納米粒子的制備

本研究采用綠色Au種子生長方法制備金納米星。Au種子合成：將過量檸檬酸鈉水溶液（3.5 mg，0.4 mL）和HAuCl4水溶液（0.25 mmol/L，9 mL）進行混合，置于磁力攪拌器上激烈攪拌。隨后，加入冰水預冷的NaBH4水溶液（0.33 mg，0.1 mL）。上述混合液在室溫條件下攪拌下2 h，得到Au種子溶液。

金納米星合成：將Au種子溶液（1.5 mL）、HAuCl4水溶液（45 mg，1.5 mL）、抗壞血酸溶液（50 mg，1 mL）和AgNO3溶液（5 mg，1 mL）混合，緩慢攪拌30 s后，加入BSA溶液（100 mg，10 mL）。室溫下攪拌12 h后離心分離（10,000 rpm，10 min），得到金納米粒子。

1.3 納米粒子的表征

我們選擇TEM觀測納米粒子的大小和形貌，DLS檢測粒徑分布，分光光度計檢測納米粒子的UV-vis-NIR吸收波譜。

1.4 細胞培養和細胞毒性實驗

快速將凍存人肝癌細胞（HepG2）復蘇，復蘇后離心，去上清，加入含15%胎牛血清DMEM培養基，在37℃和5% CO2條件下孵育。取對數生長期HepG2細胞，用5%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，加入96孔板（約5000個/孔），孵育過夜。隨后，吸出原培養基，加入含有不同濃度納米材料的培養基 200 μL（0.065、0.125、0.25、0.5、1 mmol/L）。對照組只含細胞和細胞培養基。為排除納米粒子可能對吸光度產生的干擾，在細胞孵育24 h后輕輕吸走上清液，并用PBS溶液清洗三遍。每孔加入CCK8溶液10 μL，至溶液顏色變成深黃色后使用酶標儀TECAN In finite? M1000PRO檢測吸光度值（波長450 nm），并計算細胞活性百分比。

1.5 體外PA信號檢測

本研究將激發波長設置在金納米星的SPR峰775 nm。選擇小分子PA成像對比劑亞甲藍作為參照（激發波長700 nm）。將裝有不同濃度金納米星和亞甲藍溶液的EP管于自制固定器上行掃描成像。于原始斷層圖像上勾畫ROI，記錄平均PA信號強度。勾畫ROI時盡量保證所選擇測量層面的位置相同、大小一致。

1.6 小鼠乳腺癌模型的建立

接種腫瘤前對小鼠背部皮膚脫毛。取對數生長期的4T1腫瘤細胞制成濃度為1×106個/mL的單細胞懸液，每只小鼠左上肢背部皮下接種腫瘤細胞懸液0.2 mL。接種完成后，每天觀察接種部位變化情況，每周用游標卡測量腫瘤長徑a、短徑b、高度c，根據公式：V=(a+b+c)π/s計算腫瘤近似體積。3周后，篩除瘤體過大、過小或者接種失敗的小鼠。4T1小鼠乳腺癌模型的成瘤率約為50%。選取6只瘤體大小相近，體積在0.8～1 cm3范圍內的荷瘤鼠行成像掃描。

1.7 腫瘤PA成像

Endra Nexus 128 PA 斷層掃描系統（Endra，Michigan，USA）用于成像掃描。小鼠腹腔注射2%苯巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，取側臥位并固定瘤體于掃描中心處，設置激發波長為770 nm，重復時間為3 s。尾靜脈給藥200 μL（10 mmol/L），于給藥前、給藥后5 min、30 min、1 h、2 h行動態掃描。上傳數據到Osirix Lite系統，行3D MIP重建，半定量化測量腫瘤組織和腫瘤血管的PA信號強度。血管的ROI選取在直徑最大的管徑處。瘤體的ROI勾畫盡量包括整個腫瘤組織，但要盡量避開大血管。不同時間上ROI大小、位置保持基本一致，記錄ROI內平均PA信號強度。

1.8 統計學分析

統計學分析采用SPSS 13.0軟件, 實驗結果用平均值±標準差（±s）表示，組間差異采用t檢驗法進行比較。

2 結果

2.1 金納米粒子的表征

TEM下見納米粒子呈不規則星狀結構，表面見不規則毛刺、凸起，大小分布較為均勻（圖2a）。DLS測得平均粒徑為86 nm，約95%集中分布在43～91 nm之間，如圖2b所示。通過對納米粒子的吸光度進行檢測，發現金納米星的SPR峰位于775 nm，處于近紅外（650～900 nm）區域。

圖2 納米粒子TEM圖（a）和粒徑分布（b）

良好的生物相容性是納米材料活體應用的前提。本研究中我們選擇細胞毒性試驗評價其體外生物毒性。結果顯示，最高給藥濃度條件下（1 mmol/L）的細胞活性百分比為94%（圖3b），未見明顯生物毒性。

圖3 納米粒子的UV-vis-NIR吸收波譜（a）和MTT實驗（b）

2.2 乳腺癌PA成像研究

給藥前腫瘤組織PA成像可見腹壁血管顯影（圖4）。給藥后血管信號增強，成像范圍變大，且2 h內未見明顯變化（圖5）。此外，腫瘤組織呈明顯不均勻強化，腫瘤內毛細血管可見。1 h后，PA信號強度達到最大，直至2 h后未見明顯變化（圖6）。

3 討論

隨著納米醫學的快速發展，大量新型納米材料被用于疾病診療研究[14-15]。PA成像一種新興的成像模式，近來引起人們關注，其在成像分辨率上具有顯著優勢。PA成像基于生物組織內部光學吸收的差異性，以超聲為媒介的一種生物光子成像方法。PA成像過程包括光學激發、超聲探測及圖像生成。持續短激發脈沖可以使生物組織產生聲波。聲波強度，即PA信號強度受光源、組織的熱學、光學和機械特性等影響。PA成像的激發波可以從紫外波段到紅外波段。由于散射或非閃射光都可以產生PA信號，因此深層組織內也可以產生PA信號。PA成像組織的穿透深度在厘米范圍，空間分辨率可達微米級別。PA成像可以實現細胞器、細胞、組織再到器官的多維度成像，進而提供結構、功能和分子信息。

圖4 荷瘤鼠PA圖像

圖5 給藥前和給藥后不同時間點上腹壁血管PA信號強度

圖6 給藥前和給藥后不同時間點上腫瘤組織PA信號強度

外源性造影劑的研發使PA成像的應用擴展到分子成像和基因成像，包括有機染料、報告基因和納米粒子等。為探索PA成像腫瘤的可行性及其成像特點，本研究構建合成金納米星。不同形態的金納米粒子可作為PA造影劑使用，通過將SPR調整到近紅外區，可以減少內源性造影劑的光吸收，并提高成像深度。目前，用于PA成像納米材料的主要問題是合成流程較復查，可重復性較差，部分納米材料具有毒副作用。目前我們少見將單純金納米材料用于PA成像研究。在構建納米材料的過程中，為降低納米粒子的生物毒性，提高生物相容性，通常需要在其表面行配體交換或者用兩親聚合物或者脂類表面包覆。常用的聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）包覆過程較為復查，殘留的CTAB有一定的生物毒性，且PEG不可生物降解，較難和配體相結合[16]。本研究采用金種子生長方法，以BSA為模板，來構建金納米星。BSA是天然存在的多肽聚合物，具有高生物相容性、生理條件下高穩定性、低免疫原性、可降解性和存在可修飾的官能團等諸多特點[17-18]。

本研究中金納米星的平均粒徑為86 nm，且大部分粒徑在100 nm以下。以往的研究表明，粒徑在1～100 nm的納米材料相對于其他尺寸更適用于活體成像或疾病診療等方面應用[19]。金納米星的SPR峰位于775 nm附近，處于近紅外光區（650～900 nm）。氧化血紅蛋白、還原血紅蛋白和水對近紅外光的吸收能力相對較差，因此SPR位于NIR區可以提高成像的組織穿透深度和信號噪聲比，更只用于生物組織成像。細胞毒性實驗結果表明納米粒子具有很好的生物相容性。同PEG包覆相比，BSA包覆的納米材料可能更適用于活體成像應用[9,20]。

生物組織內有很多內源性PA對比劑，如DNA/RNA、血紅蛋白和黑色素。為可視、辨別腫瘤組織和正常組織，通常需要外源性PA對比劑。為探索金納米星腫瘤對比增強效果，經尾靜脈給藥后（10 mmol/L，200 μL）不同時間點進行腫瘤成像掃描。從3D MIP圖和PA信號強度檢測結果中可以看出，金納米星可以提供很好的PA對比增強效果和居于較長的血液循環時間。血紅蛋白是活體內天然存在的PA對比劑，因此在給藥前成像組織血管可見。給藥1 h腫瘤組織的PA信號強度接近最大，約為給藥前的3倍，說明金納米星具有良好的增強滲透保留（Enhanced Permeability and Retention，EPR）效應。EPR效應是因為腫瘤組織血管密度較高且血管內皮結構不完整，加上淋巴系統受損，納米粒子在腫瘤組織長時間高濃度聚集的現象[21]。EPR效應有助于腫瘤顯像，提高腫瘤診斷的靈敏性，是腫瘤靶向成像和治療的基礎。此外，由于具有光聲效應的納米材料，同時也具有光熱轉化效應，本研究中納米粒子也適用于腫瘤光熱治療。雖然PA在成像靈敏性和分辨率方面具有一定的優勢，但由于組織穿透深度限制，目前的PA成像研究也多選擇乳腺癌作為靶向研究對象[4,22]。在本部分研究結果表明金納米星適用于進一步腫瘤靶向成像、治療探針的研發，這為我們未來的腫瘤靶向成像與治療工作的進行打下良好基礎。

4 結論

總之，我們證實了一種的新型的可用于PA成像的金納米粒子對比劑。本研究中應用的合成方法簡單、可重復性好。金納米星展現出良好的生物相容性、光聲轉化效應，有望為腫瘤靶向PA成像及光熱治療提供新的研究方向。此外PA成像容易操作、可重復性好、成本低、高分辨率成像、高靈敏性，具有巨大的臨床應用潛能。