分光光度法同時測定油脂中氫過氧化物和醛含量

向思敏，朱振中，王巍巍

(江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122)

油脂在光、熱、金屬催化劑、微生物和水的影響下會發生氧化或水解，形成脂質氫過氧化物(初級氧化產物)。脂質氫過氧化物在高溫或者金屬存在時易分解形成醛、酮、酸、酯、醇和短鏈烴等次級氧化產物[1]。目前檢測油脂初級氧化產物的方法有比色法[2]、化學發光法[3]、FTIR法[4-5]和電化學方法[6-7]等。其中比色法常用的有亞鐵二甲酚橙法[2]、五磺基水楊酸法[8]和硫氰化鐵法[9]，此類方法均是利用氫過氧化物的氧化性；化學發光法主要是基于堿性魯米諾與氫過氧化物的化學發光反應；FTIR 則是利用特征性光譜進行定性或定量分析；電化學方法中用得較多的是測電導率和阻抗。檢測次級氧化產物的方法有液相色譜質譜聯用法[10]和氣相色譜質譜聯用法[11]，常用的衍生化試劑有2,4-二硝基苯肼和2-硫代巴比妥酸，均是利用羰基化合物與胺類的親核加成反應。

目前國內外有關評價油脂氧化穩定性的方法主要是基于測定油脂的初級氧化產物(如氫過氧化物)或者次級氧化產物(如羰基類化合物)，僅評價一種氧化產物使評價的可靠性或準確性難以保證。而分別測定油脂的初級氧化產物或次級氧化產物，將使分析評價過程較為煩瑣費時和不經濟。若能同時測定油脂的初級氧化產物和次級氧化產物，將使油脂氧化穩定性的評價結果更為可靠和準確。但有關同時測定油脂的初級氧化產物和次級氧化產物的研究鮮見報道。本文以N，N-二甲基對苯二胺為顯色劑，利用胺的還原性和親核性分別與氫過氧化物和羰基反應，以達到同時測定油脂氧化過程中氫過氧化物和醛的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

鱷梨油由上海家化聯合股份有限公司提供，大豆油購于超市。N，N-二甲基對苯二胺鹽酸鹽、乙酸、氯化鋁、鹽酸、無水乙醇、過氧化氫(30%)、三氯甲烷、甲醇、還原鐵粉、無水氯化亞鐵、硫氰酸鉀、1,1,3,3-四乙氧基丙烷、硫代巴比妥酸、三氯乙酸和乙二胺四乙酸二鈉，均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；實驗用水均為超純水。

1.1.2 儀器與設備

超聲波清洗儀，數顯式電熱恒溫水浴鍋，雙光束紫外可見分光光度計，721分光光度計，DHG-9033B5-Ⅲ鼓風干燥箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

配制7.6 mmol/L N,N-二甲基對苯二胺乙醇溶液，8 mmol/L過氧化氫乙醇溶液，3.8 mmol/L丙二醛(MDA)溶液。

配制過氧化氫和丙二醛混合溶液：含0.67 mmol/L的過氧化氫和0.76 mmol/L的丙二醛。

1.2.2 過氧化氫和丙二醛標準曲線的繪制

取不同體積的過氧化氫乙醇溶液于5 mL比色管中，加入1 mL 2.74 mmol/L的乙酸溶液和2 mL 7.6 mmol/L N,N-二甲基對苯二胺乙醇溶液，用乙醇定容至5 mL，配制成0.08、0.12、0.20、0.40、0.67、1.00、1.33、2.00 mmol/L的過氧化氫標準溶液，40℃加熱40 min后，以未加過氧化氫的溶液為參比，在340～410 nm處測定吸光度，在最大吸收波長處繪制過氧化氫溶液的標準曲線。

同樣的方法配制0.15、0.23、0.38、0.76、1.26、1.89、2.53 mmol/L的丙二醛標準溶液，40℃加熱40 min，以未加丙二醛的溶液為參比，在340～410 nm處測定吸光度，在最大吸收波長處繪制丙二醛溶液的標準曲線。

1.2.3 油脂中的氫過氧化物和醛含量的測定

取適量油脂于120℃烘箱中加熱不同時間后取0.05 mL置于5 mL比色管中，用乙醇溶解，加入1 mL 2.74 mmol/L乙酸，2 mL 7.6 mmol/L N,N-二甲基對苯二胺乙醇溶液，用乙醇定容至5 mL，40℃加熱40 min，分別在350 nm和408 nm處測定吸光度，根據標準曲線求油脂中氫過氧化物和醛的含量。

同時參考GB/T 5009.37—2003中的植物油過氧化值的測定方法和GB/T 5009.181—2003中丙二醛的測定方法，測定油脂中的氫過氧化物和丙二醛的含量。

1.2.4 雙變量校準方法(Kaiser法)[12]

分光光度法測定選定波長(λi)下分析物A的線性校正回歸函數為：

AAi=mAi·CA+eAi

(1)

式中：AAi為波長λi處的吸光度；mAi為線性回歸的斜率；CA為分析物A的濃度；eAi為截距。

如果二元混合物(A，B)的測定是在兩個選定波長(λ1和λ2)下進行的，則：

AAB1=mA1·CA+mB1·CB+eAB1

(2)

AAB2=mA2·CA+mB2·CB+eAB2

(3)

式中：AAB1為混合物A、B在波長λ1處的吸光度之和；AAB2為混合物A、B在波長λ2處的吸光度之和；eAB1和eAB2分別為λ1和λ2處線性校準的截距之和(eABi=eAi+eBi)。

聯立式(2)和式(3)，求得CA和CB的值：

CA=(AAB1-eAB1-mB1CB)/mA1

(4)

CB=[mA2(AAB1-eAB1)+mA1(eAB2-AAB2)]/(mA2mB1-mA1mB2)

(5)

為獲得測定混合物(A,B)的最佳波長，用 Kaiser 法在兩個選定波長下測定混合物的吸光度來解析二元混合物，并使用線性回歸函數的參數在相同波長處評估每個組分，對每個二元混合物和每對預選波長創建一系列靈敏度矩陣K：

(6)

式中：mA1、mA2為組分A在選定波長(λ1，λ2)處的靈敏度參數的斜率；mB1、mB2為組分B在選定波長(λ1，λ2)處的靈敏度參數的斜率。計算此系列矩陣的分辨率，選擇具有最高絕對矩陣行列式值的波長集為測定混合物(A,B)的最佳波長。

2 結果與討論

2.1 紫外吸收光譜

分別將0.67 mmol/L的過氧化氫(H2O2)、0.76 mmol/L的丙二醛(MDA)及二者的混合物，以1 mL 2.74 mmol/L乙酸作催化劑，在40℃下與顯色劑反應40 min，得到的紫外吸收光譜圖如圖1所示。

圖1 MDA、H2O2、MDA+H2O2的紫外吸收光譜圖

由圖1可以看出，過氧化氫在348 nm處有較強的吸收，丙二醛在400 nm處有較強的吸收。但混合溶液在348 nm和400 nm處均存在光譜重疊，導致吸收峰不易觀察，難以同時測定混合物中的分析物。為此，采用Kaiser方法選擇混合物在這一段波長范圍內測定最佳波長。

2.2 最佳波長的選擇

按1.2.2分別繪制過氧化氫(348 nm)和丙二醛(400 nm)的吸光度(Y)隨濃度(X)變化曲線。過氧化氫在0.08～2.00 mmol/L范圍內與吸光度呈良好的線性關系，其線性方程為：Y=0.379 2X-0.000 7，R2=0.999 1，檢出限為0.006 mmol/L。丙二醛在0.15～2.53 mmol/L范圍內與吸光度有較好的線性關系，其線性方程為：Y=0.15X+0.028，R2=0.999 1，檢出限為0.03 mmol/L。

用Kaiser方法在340～410 nm范圍內選定11個波長，分別由式(1)和式(6)求過氧化氫和丙二醛的斜率及靈敏度矩陣行列式的絕對值，結果見表1和表2。

由表2可知，350 nm和408 nm處的靈敏度矩陣行列式的絕對值最大，故選擇350 nm和408 nm作為同時測定混合溶液中過氧化物和丙二醛含量的最佳測定波長。

表1 H2O2和MDA的線性回歸校準的斜率

表2 靈敏度矩陣行列式的絕對值(K×10-4)

2.3 反應條件的優化

2.3.1 催化劑的選擇

取1 mL過氧化氫和丙二醛混合溶液，加入2 mL 7.6 mmol/L顯色劑、1 mL 2.74 mmol/L不同種類的酸，用乙醇定容至5 mL，40℃反應40 min，以未加催化劑的溶液為參比，測定330～420 nm范圍的吸收峰面積，結果如圖2所示。

圖2 不同種類的酸催化劑對反應的影響

由圖2可知，濃鹽酸能使顯色的顏色迅速褪去，吸光度無明顯增大，乙酸和氯化鋁對吸光度的增加較為明顯。其中，乙酸的效果最好，故選擇乙酸作為催化劑。

2.3.2 顯色劑最佳濃度的選擇

取1 mL過氧化氫和丙二醛混合溶液，加入1 mL 2.74 mmol/L的乙酸、2 mL不同濃度的顯色劑溶液，用乙醇定容至5 mL，以未加顯色劑的溶液為參比，對混合溶液在40℃下加熱40 min，在350 nm和408 nm處測定吸光度，結果見圖3。

圖3 吸光度隨顯色劑濃度的變化

從圖3可以看出，350 nm和408 nm處的吸光度均隨顯色劑濃度的增加而增大。當顯色劑濃度高于7.6 mmol/L后，吸光度的增加趨緩。故選擇顯色劑的濃度為7.6 mmol/L。

2.3.3 反應溫度和反應時間的影響

取1 mL過氧化氫和丙二醛混合溶液，加入1 mL 2.74 mmol/L的乙酸、2 mL 7.6 mmol/L的顯色劑溶液，用乙醇定容至5 mL，分別在30、40、50℃下加熱不同時間，以不含混合液的溶液作參比，在350 nm處測定吸光度，結果見圖4。

圖4 反應溫度和反應時間對吸光度的影響

由圖4可知，隨反應溫度的升高，吸光度達最大值所需的時間越短，30℃為50 min，40℃為40 min，50℃為30 min。但反應溫度越高，吸光度達到最高后經一段時間后會緩慢降低。故選擇40℃反應40 min作為本方法的反應溫度和反應時間。

2.4 油脂中氫過氧化物和丙二醛的同時測定

以350 nm和408 nm為混合溶液的測定波長，結合式(1)分別得出混合溶液中過氧化氫和丙二醛在不同波長處的線性回歸方程，結果見表3。

表3 混合溶液中過氧化氫和丙二醛的

根據表3中回歸方程的相關參數及在350 nm和408 nm處分別測定的混合液的吸光度，由式(4)和式(5)即可求出氫過氧化物和醛的濃度。

按1.2.3分別測定大豆油和鱷梨油在120℃加熱不同時間的氫過氧化物和丙二醛的含量，同時按國標法測定二者的含量，結果見表4。在置信度為95%下，計算F值和t值，比較兩種方法的顯著性，結果見表5。

表4 大豆油和鱷梨油的氫過氧化物含量和丙二醛含量

表5 方法的顯著性檢驗

由表4可知，大豆油和鱷梨油的氫過氧化物含量和丙二醛含量均隨加熱時間的延長而增大，且鱷梨油的氫過氧化物含量和丙二醛含量的變化較大豆油的大，說明鱷梨油較大豆油更易氧化。從表4還可得出，丙二醛含量的增速較氫過氧化物緩，且丙二醛含量遠小于氫過氧化物含量，可能是由于丙二醛是次級氧化產物再降解而形成的低相對分子質量的產物。此外，國標法所測的氫過氧化含量值與本方法的測定結果相近，而國標法所測的丙二醛含量均比本方法的測定值略小，可能是由于油脂氧化過程中除丙二醛外其他的單鏈醛也有吸收而引起。

由表5可知，在置信度為95%時，大豆油、鱷梨油的F值和t值均小于F(0.05,3)和t(0.10,3)，說明兩種測定方法之間不存在顯著性差異。

3 結 論

本文建立了一種分光光度法同時測定油脂中氫過氧化物和醛含量方法，所測結果與國標法對比均無顯著性差異。由于該方法能同時測定油脂的初級氧化產物和次級氧化產物，可為評價油脂氧化穩定性提供更為可靠和準確的參數，也可為構建預測油脂貨架期模型提供新的思路。