梔子油對ConA誘導的小鼠急性免疫性肝損傷的保護作用

朱梓豪，羅光明，張風波，張俊逸，柴華文，劉培培，王得運，艾永強

(江西中醫藥大學 藥學院，南昌 330004)

研究表明，肝臟疾病是對人類健康造成損害的重要疾病之一，而肝內免疫反應是引起肝細胞損傷的重要原因[1]，其中T淋巴細胞介導的異常免疫應答是引起肝細胞損傷及破壞的直接因素[2]。因此，多種免疫效應細胞及細胞因子參與的免疫反應在肝損傷的發生及發展過程中起到關鍵作用。

梔子為市面上常見大宗藥材之一，來源于茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實[3]，性苦、味寒，具有瀉火除煩、涼血解毒的功效，主要含有環烯醚萜類、有機酸類和梔子黃色素等成分[4]。目前國內外對梔子現代藥理研究及藥物開發主要是針對環烯醚萜類成分，少有對梔子油進行藥理研究。本課題組前期建立四氯化碳致肝損傷模型，得到梔子油對四氯化碳所致急性肝損傷具有保護作用[5-6]，現采用刀豆蛋白A(ConA)建立免疫性肝損傷模型，探討梔子油對ConA誘導的免疫性肝損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級KM雄性小鼠，體重16～20 g，共72只，由山東省實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK(魯)20140007。于江西中醫藥大學實驗大樓動物房飼養，自由進食進水，適應3 d，動物房溫度25～28℃，濕度35%～55%。

1.1.2 藥品與試劑

梔子，購于江西省九江市湖口縣順昌梔子藥材基地，經江西中醫藥大學中藥資源學科羅光明教授鑒定為茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實；丙氨酸氨基轉移酶(ALT，批號:20170611)、天門冬氨酸轉移酶(AST，批號:20170607)、乳酸脫氫酶(LDH，批號：20170614)、一氧化氮(NO，批號：20170528)、超氧化物歧化酶(SOD，批號:20170615)和丙二醛(MDA，批號:20170610)試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。蘇木素-伊紅染液(批號：20170428)，購于南京建成生物工程研究所，聯苯雙酯滴丸(生產批號: 160605，每丸1.5 mg，購于浙江萬邦藥業股份有限公司)。

動物組織總RNA 提取試劑盒，天根生物科技(北京)有限公司，生產批號：P4805；反轉錄試劑盒，普洛麥格生物技術有限公司(USA)，生產批號：ADA5000 00002284267；內參GAPDH、TNF-α、IFN-γ、CXCL-10引物，合成于捷瑞生物科技工程有限公司(上海)。引物具體序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.1.3 儀器與設備

DY89- II電動勻漿機；UV-1800型紫外可見光分光光度計，島津公司(日本)；MULTISKAN GO酶標儀，賽默飛世爾科技公司(上海)；Allegra64R 高速冷凍離心機，美國Beckman公司；凝膠成像儀，美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 梔子油的提取

取干燥后的梔子藥材，粉碎后，過20目篩，加5倍量的石油醚，85℃索氏提取3 h，提取結束后旋蒸回收石油醚，得梔子油，稱重并計算其得率，4℃冰箱保存備用。

1.2.2 實驗分組及給藥

取60只昆明小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為空白組、免疫性肝損傷模型組、聯苯雙酯陽性組(200 mg/kg)，梔子油低劑量組(0.3 g/kg)、梔子油中劑量組(0.6 g/kg)、梔子油高劑量組(1.2 g/kg)，梔子油劑量在得率及藥典梔子生藥推薦攝入量的基礎上得到，梔子油劑量組用0.5%吐溫-80溶液進行溶解。小鼠適應性飼養3 d后開始給藥，空白組和免疫性肝損傷模型組小鼠經口灌胃0.5%吐溫-80溶液，其他各組小鼠灌胃相應的藥物，每天1次，連續給藥10 d 。

1.2.3 免疫性肝損傷改良模型建立[7-8]

采用改良后的造模方法，連續給藥10 d，末次給藥1 h后，除空白組小鼠給予相同劑量的注射生理鹽水外，其余各組小鼠一次性尾靜脈注射ConA 15 mg/kg，禁食不禁水8 h，然后處理小鼠，取材檢測。

1.2.4 血清ALT、AST、LDH水平測定

造模后8 h，小鼠進行摘眼球取血，4℃、全血3 000 r/min離心10 min，分離血清，按照試劑盒說明書檢測血清中ALT、AST、LDH水平。

1.2.5 小鼠肝臟SOD、MDA、NO水平測定

小鼠取血后處死，取0.1 g肝臟組織，加4℃生理鹽水制成 10%的肝勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，檢測SOD、MDA、NO水平。

1.2.6 肝臟病理學觀察

取小鼠相同部位的肝組織，用10%甲醛溶液固定，之后進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片展片、HE染色，光學顯微鏡下觀察肝組織病理學變化。

1.2.7 RT- PCR檢測肝臟組織中TNF-α、IFN-γ、CXCL-10 mRNA的表達水平

取小鼠相同部位肝組織，用動物組織總RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，以GAPDH作為參照基因進行擴增，檢測肝組織中TNF-α、IFN-γ、CXCL-10 mRNA的表達水平，實驗操作步驟均按試劑盒說明書進行。

1.2.8 數據分析

2 結果與討論

2.1 梔子油對ConA致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST、LDH水平的影響(見表2)

表2 梔子油對小鼠血清 ALT、AST 和LDH水平的影響 U/L

注：與空白組比較，△p<0.05，△△p<0.01，△△△p<0.001；與模型組相比，*p<0.05，* *p<0.01，* * *p<0.001。下同。

由表2可知，與空白組相比，模型組小鼠血清 ALT、AST及LDH水平極顯著升高(p<0.001)，具有顯著性差異，符合統計學意義，表明免疫性肝損傷模型建造成功。與模型組相比，聯苯雙酯組小鼠血清中ALT、AST和LDH水平均極顯著下降(p<0.001)，具有統計學意義；梔子油中、高劑量組小鼠血清中ALT、AST和LDH水平均具有顯著或極顯著性降低趨勢(p<0.05，p<0.001)，且高劑量組優于中劑量組，呈劑量依賴性。表明梔子油對ConA誘導的小鼠免疫性肝損傷具有一定的保護作用。

2.2 梔子油對Con A致急性肝損傷小鼠肝臟組織NO、SOD和MDA的影響(見表3)

表3 梔子油對小鼠肝臟組織NO、SOD和MDA水平的影響

由表3可知，與空白組比較，模型組小鼠肝組織產生了明顯的氧化應激反應，表現在NO和MDA水平極顯著提高(p<0.001)，SOD活力極顯著降低(p<0.001)，具有統計學意義。與模型組相比，梔子油低、中、高劑量組NO和MDA 水平顯著或極顯著降低(p<0.05,p<0.01,p<0.001)，SOD水平顯著或極顯著地升高(p<0.05,p<0.001)，且具有統計學意義，改善程度高劑量組優于中低劑量組，呈劑量依賴性。

2.3 梔子油對ConA致急性肝損傷小鼠肝臟組織TNF-α 、CXCL-10、IFN-γ mRNA 表達的影響(見圖1)

由圖1可知，與空白組相比，急性免疫性肝損傷模型組小鼠肝臟組織 TNF-α、CXCL-10、IFN-γ mRNA的相對表達量發生極顯著性增高，差異有統計學意義(p<0.001)。與模型組比較，聯苯雙酯組小鼠肝組織中TNF-α、CXCL-10、IFN-γ mRNA的相對表達量極顯著降低，差異具有統計學意義(p<0.001)；梔子油低、中、高劑量組均顯著或極顯著地降低了小鼠肝組織中 TNF-α、CXCL-10、IFN-γ mRNA的相對表達量，差異均具有統計學意義(p<0.05，p<0.01,p<0.001)。

2.4 肝臟病理學檢查(見圖2)

由圖2可知，光鏡下觀察空白組小鼠肝組織結構清晰，肝小葉結構正常，肝細胞呈放射狀圍繞中央靜脈，排列整齊，匯管區無異常，未發生細胞壞死及炎性浸潤現象。模型組小鼠肝組織出現明顯的肝小葉紊亂，細胞腫脹及浸潤，排列無規律，肝組織嚴重損傷；聯苯雙酯組小鼠肝組織細胞變性、腫脹及壞死情況較模型組均不同程度改善，但仍有少量炎性細胞浸潤；與模型組比較，梔子油各劑量組小鼠肝組織損傷情況呈不同程度改善，肝小葉紊亂情況改良，細胞水腫及壞死情況均有不同程度減輕，細胞炎性浸潤狀況也減弱，且高劑量組改善情況明顯優于中、低劑量組，說明梔子油對肝損傷具有保護作用且呈劑量依賴性。

2.5 討論

刀豆蛋白A為一種糖類結合蛋白質，是一種植物血凝素，具有強力的促進有絲分裂作用，能較好地促淋巴細胞轉化反應，其誘導的小鼠肝損傷模型與人體急慢病毒、自身免疫性缺陷導致的肝病相似[9]，是探討免疫性肝病機制及篩選抗肝損傷藥物的理想模型之一。

3 結 論

本實驗設定梔子油3個給藥劑量，與模型組相比，梔子油各劑量組均能降低血清ALT、AST和LDH含量，提高肝臟SOD活性，降低肝組織NO、MDA的產生，RT-PCR檢測結果顯示肝組織中TNF-α、CXCL-10、IFN-γ mRNA的相對表達量降低，肝臟病理學觀察表明肝組織變性及壞死等病理癥狀明顯改善，且呈現一定的劑量依賴趨勢，其保肝的機制可能與提高肝組織抗氧化酶體系活力，抑制氧化應激反應及炎性因子表達有關。