油茶葉多酚的提取工藝優化及其體外抗氧化性的研究

藍梧濤，吳雪輝，2，章 文，王澤富，江盛宇

(1.華南農業大學 食品學院，廣州 510642； 2.廣東省油茶工程技術研究中心，廣州 510642)

多酚是苯環上具有多元酚羥基結構的化合物總稱，廣泛分布于植物中的各個部分，具有較強的清除自由基、抗腫瘤、抗炎抗癌、降血脂的作用，在食品、藥品、營養保健、日用化工等領域具有良好的應用價值[1-2]。據報道[3-4]，被作為廢棄物丟棄的植物葉片中含有較高含量的多酚，若能合理開發，必然具有重要的應用價值。

油茶籽油含有多種活性成分，具有較高的保健價值及藥用功效，長期食用有益于人體健康[5-7]。近些年，油茶的種植面積逐年增加，為促進油茶的生長發育及提高油茶果產量，每年需要對油茶樹進行修枝整形，在此過程中會產生大量的油茶葉，而大部分油茶葉利用度較低[8-11]。

研究表明，油茶葉富含多酚、黃酮、多糖、三萜皂苷、甾體等物質，其提取液具有降血糖、抗凝血、抗血栓形成等功效，若能有效利用其中的活性成分，可以提高油茶的經濟價值[12-13]。目前與油茶葉活性成分相關的研究主要集中在黃酮[14-15]，針對多酚的研究相對較少。為了進一步研究油茶葉多酚的功效，本文以油茶葉為原料，研究油茶葉中多酚的提取工藝，并對油茶葉多酚與VC進行體外抗氧化活性的分析，以充分利用油茶葉資源，變廢為寶，推動油茶產業的發展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

油茶葉，采摘于華南農業大學增城寧西教學科研基地。

無水乙醇、無水碳酸鈉、福林酚、過硫酸鉀、濃鹽酸、Tris、鄰苯三酚、抗壞血酸：分析純；沒食子酸、DPPH、ABTS標準品。

BSA223S型分析天平，UV-5200紫外可見分光光度計，JB-3型恒溫磁力攪拌器，WRH-100TB1型閉環除濕熱泵干燥機，BJ-150型多功能粉碎機，SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料的預處理

新鮮、無病蟲害的油茶葉采用熱泵于60℃條件下干燥至恒重，粉碎，收集40～60目的粉末，備用。

1.2.2 油茶葉多酚的提取

稱取適量油茶葉粉末，加入一定體積分數的乙醇溶液，在適宜的溫度下進行攪拌提取一段時間，抽濾收集提取液，定容至50 mL，測定多酚含量，并按下式計算多酚提取量。

式中：C為根據標準曲線計算出的提取液中多酚質量濃度，μg/mL；N為稀釋倍數；M為油茶葉質量,g。

1.2.3 多酚含量的測定

多酚含量按照GB/T 8313—2008的步驟，采用福林酚比色法進行測定[16]。

1.2.4 體外抗氧化活性測定

DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力的測定參照文獻[17]進行。

1.2.5 數據處理

所有試驗重復3次，采用Design-Expert 8.0.6、Origin 9.0、Matlab R2016b軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數對多酚提取量的影響

稱取1.000 g油茶葉粉末5份，分別加入體積分數20%、30%、40%、50%、60%的乙醇溶液40 mL，在50℃的條件下攪拌提取15 min，抽濾收集提取液定容至50 mL，測定吸光值并計算多酚的提取量。結果見圖1。

圖1 乙醇體積分數對多酚提取量的影響

由圖1可知，隨著乙醇體積分數的增加，多酚提取量呈現先增加后降低的趨勢，乙醇體積分數在30%～50%范圍內，多酚提取量較高，這是由于多酚屬于弱極性物質，在一定范圍內，隨著乙醇體積分數的增加，溶液體系的極性降低，使得提取量增大。當乙醇體積分數超過50%時，多酚提取量開始下降，可能是由于溶液體系的極性與油茶葉多酚極性之間的差異增大，導致提取量降低。

2.1.2 提取時間對多酚提取量的影響

以40%的乙醇溶液為提取溶劑，提取時間分別為5、15、25、35、45 min，其余條件同2.1.1進行提取。結果見圖2。

圖2 提取時間對多酚提取量的影響

由圖2可知，隨著提取時間的延長，多酚提取量逐漸增加，當提取時間達到35 min時，多酚提取量最大，為56.71 mg/g，此后，延長提取時間，提取量反而有所下降。根據菲克定理，在一定范圍內，油茶葉顆粒內部與溶劑中的多酚濃度差較大，提取時間與多酚提取量呈現較好的線性關系，隨著提取時間延長，顆粒內外濃度差逐漸趨于平衡，提取量不再增大，再延長提取時間，提取量下降可能是由于多酚暴露在空氣中，發生部分氧化。

2.1.3 提取溫度對多酚提取量的影響

分別設定提取溫度為30、40、50、60、70℃，乙醇體積分數為40%，其余條件同2.1.1進行提取。結果見圖3。

圖3 提取溫度對多酚提取量的影響

由圖3可知，多酚提取量隨著提取溫度的升高先增加后降低。這是由于適當地升高提取溫度，分子運動速率加快，有利于油茶葉多酚的溶出。當提取溫度達到60℃時，多酚提取量最高，為59.91 mg/g。

2.1.4 料液比對多酚提取量的影響

以40%的乙醇溶液為提取溶劑，料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，其余條件同2.1.1進行提取。結果見圖4。

圖4 料液比對多酚提取量的影響

由圖4可知，隨著料液比的增加，多酚提取量迅速增大，這是由于增大溶劑用量，有利于多酚物質由顆粒內部向溶劑擴散。當料液比為1∶60時，多酚提取量達到57.27 mg/g，此后再增大料液比，多酚提取量基本不變。

2.2 響應面優化試驗

在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken試驗設計原理，選取提取時間(X1)、提取溫度(X2)、乙醇體積分數(X3)、料液比(X4)作為自變量，油茶葉多酚提取量(Y)為響應值，設計四因素三水平響應面試驗方案。響應面試驗因素水平見表1，響應面Box-Behnken試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平

表2 響應面Box-Behnken試驗設計及結果

采用Design-Expert軟件對表2的數據進行回歸擬合，得到多酚提取量(Y)的二元多項回歸方程：

對回歸方程進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸方程方差分析

注：* *差異極顯著(P<0.01),*差異顯著(P<0.05)。

通過對模型的擬合分析，預測出最佳的提取條件為：提取時間35 min，提取溫度68.84℃，乙醇體積分數31.63%，料液比1∶68.41，預測的油茶葉多酚提取量為68.18 mg/g。

2.3 驗證試驗

為了驗證模型的準確性，考慮到實際操作，將各因素調整為提取時間35 min、提取溫度69℃、乙醇體積分數32%、料液比1∶69，進行驗證試驗，得到油茶葉多酚提取量為67.31 mg/g,預測值與實測值的相對誤差為1.29%。說明模型能較好地預測油茶葉多酚提取量。

2.4 油茶葉多酚對DPPH·的清除能力

圖5為不同質量濃度的油茶葉多酚和VC對DPPH·的清除效果。

圖5 油茶葉多酚和VC清除DPPH·的比較

由圖5可知，在一定范圍內，隨著質量濃度的增加，油茶葉多酚和VC對DPPH·的清除率均逐漸增大，表現出較好的抗氧化效果。在質量濃度為3.9～11.36 μg/mL范圍內，油茶葉多酚對DPPH·的清除率與質量濃度呈現一定的線性相關性，回歸方程為Y=0.055 8X+0.272 5(R2=0.973 9)，IC50值為4.22 μg/mL，當質量濃度超過11.36 μg/mL，清除率緩慢升高，最大清除率為90.2%；對于VC，在質量濃度為3.82～15.26 μg/mL范圍內，線性回歸方程為Y=0.054 5X+0.022 6(R2=0.984 6)，IC50值為8.073 μg/mL，最大清除率略低于油茶葉多酚，為81.86%。綜上所述，油茶葉多酚較VC對DPPH·清除能力更強。

2.5 油茶葉多酚對ABTS+·的清除能力

圖6為不同質量濃度的油茶葉多酚與VC清除ABTS+·的能力。

由圖6可知，油茶葉多酚對ABTS+·的清除能力與質量濃度呈正相關的關系，質量濃度越大，清除能力越好，IC50值為5.22 μg/mL，當質量濃度為19.17 μg/mL時，ABTS+·清除率達到100%。而VC的IC50值為8.69 μg/mL，在19.17 μg/mL時，ABTS+·清除率達到99.65%。由此可知，與清除DPPH·的結果類似，油茶葉多酚清除ABTS+·的活性同樣優于VC，并且當油茶葉多酚達到一定的質量濃度時，能完全清除ABTS+·。

圖6 油茶葉多酚和VC清除ABTS+·的比較

2.6 油茶葉多酚對的清除能力

圖7 油茶葉多酚和VC清除的比較

3 結 論

在單因素試驗的基礎上，通過響應面試驗優化得到油茶葉多酚的最佳提取條件為提取時間35 min、提取溫度69℃、乙醇體積分數32%、料液比1∶69，在此條件下，油茶葉多酚的提取量為67.31 mg/g。