元寶楓翅果3種活性成分及抗氧化能力研究

王 瑤，牛立新，白章振，張曉驍，張延龍，王 寧

(西北農林科技大學 風景園林藝術學院，陜西 楊凌 712100)

元寶楓(AcertruncatumBunge.)為槭樹科(Aceraceae)槭樹屬(Acer)植物，因翅果形狀像中國古代“金錠元寶”而得名，在我國分布范圍廣，是我國特有樹種[1]。元寶楓不僅具有觀賞價值，還具有油用價值。元寶楓種仁中含油量達42%～48%[2-3]，油中不飽和脂肪酸占90%以上[1]，且含有約5.8%的特殊脂肪酸——神經酸，脂溶性維生素E含量高達125.23 mg/100 g[4]，具有良好的抗菌、抗腫瘤作用[5-6]。2011年3月，我國衛生部批準元寶楓籽油作為新資源食品，使元寶楓成為我國重要木本油料資源。果翅、種皮和提取油脂后的仁粕，是元寶楓籽油生產過程中的副產物。果翅中含有單寧、槲皮素、山柰酚、異鼠李素[7]，種皮中含有大量的縮合單寧[8]，種仁中含有多種多酚類物質[9]。這些天然活性物質屬于植物次級代謝過程中的重要產物，能夠通過清除過多的自由基，從而避免機體損傷，避免多種疾病的發生，對于延長食品保質期和促進人體健康有著非常重要的作用[10]。目前，對元寶楓翅果不同部位活性物質含量和抗氧化能力尚缺乏系統研究，弄清有關問題對于進一步充分綜合利用元寶楓果實有著重要的作用。

本研究在對元寶楓果翅、種皮及仁粕中總酚、縮合單寧、總黃酮含量比較分析的基礎上，對其FRAP抗氧化能力、對DPPH自由基和ABTS+·的清除作用進行了分析研究，為元寶楓翅果綜合利用提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

元寶楓翅果于2017年11月8日采自陜西省楊陵區西北農林科技大學校園內，采后將果翅、種皮和種仁分開，38℃烘干后粉碎，過60目篩，密封保存于4℃備用。種仁采用超臨界CO2充分萃取油脂后得到仁粕，密封保存于4℃備用。

乙醇、甲醇、冰醋酸、鹽酸、三氯化鐵，均為分析純；福林酚試劑；無水碳酸鈉、亞硝酸鈉、結晶氯化鋁、鹽酸、香蘭素、醋酸鈉，均為分析純；水溶性維生素E(Trolox)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、沒食子酸、蘆丁、兒茶素標準品，均為色譜純，美國Sigma公司。

1.1.2 儀器與設備

GENSYS10S紫外可見-分光光度計，美國Thermo公司；SFE-2型超臨界CO2萃取儀，美國應用分離公司；RE-52AA 型旋轉蒸發儀；SP-Max2300AZ光吸收型全波長酶標儀；101型電熱鼓風干燥箱；KQ-500DE型數控超聲波清洗器；KDC-140HR高速冷凍離心機；FW-400A高速萬能粉碎機。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

分別準確稱取0.5 g元寶楓果翅、種皮、仁粕粉末，各加入10 mL 70% 的乙醇，靜置3 h后在25℃超聲處理50 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液，剩余殘渣在相同的超聲條件下提取2次，合并上清液，旋轉蒸發濃縮后用70%的乙醇定容至25 mL，避光密封保存于-20℃冰箱中用于后續實驗分析。

1.2.2 總酚含量測定

采用福林酚比色法[11]測定，以沒食子酸作為標準品。取稀釋至適當濃度的樣品提取液0.5 mL于10 mL離心管中，再加入2.5 mL福林酚試劑(0.2 mol/L)，靜置5 min后加入2 mL碳酸鈉溶液(75 g/L)，混勻，在黑暗處放置1.5 h后在765 nm處測定吸光值。以蒸餾水代替碳酸鈉溶液(75 g/L)的反應體系為空白對照，根據標準曲線計算總酚含量，結果表示為每克樣品中毫克沒食子酸當量(mgGAE/g)。每個樣品重復測定3次。

1.2.3 縮合單寧含量測定

采用香草醛鹽酸法[12]測定，以兒茶素作為標準品。取稀釋至適當濃度的樣品提取液1 mL于10 mL離心管中，依次向離心管中加入6 mL 4%的香草醛甲醇溶液、3 mL濃鹽酸，混勻，在25℃避光條件下反應30 min后在500 nm處測定吸光值。以甲醇代替4%的香草醛甲醇溶液的反應體系為空白對照，根據標準曲線計算縮合單寧含量，結果表示為每克樣品中毫克兒茶素當量(mgCE/g)。每個樣品重復測定3次。

1.2.4 總黃酮含量測定

采用氯化鋁比色法[13]測定，以蘆丁作為標準品。取稀釋至適當濃度的樣品提取液5.4 mL于10 mL離心管中，依次向離心管中加入0.3 mL亞硝酸鈉溶液(0.5 mol/L)、0.3 mL氯化鋁溶液(0.3 mol/L)，靜置5 min后加入4 mL氫氧化鈉溶液(1 mol/L)，4 000 r/min離心2 min后在510 nm處測定吸光值，以蒸餾水代替氯化鋁溶液(0.3 mol/L)的反應體系為空白對照，根據標準曲線計算總黃酮含量，結果表示為每克樣品中毫克蘆丁當量(mgRT/g)。每個樣品重復測定3次。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測定[14]

稱取一定質量的DPPH自由基，以無水乙醇為溶劑，配制成濃度為2.2×10-4mol/L的DPPH自由基溶液，分別取稀釋到不同濃度的樣品100 μL與100 μL DPPH自由基溶液于96孔酶標板中混合，25℃避光孵育35 min后在517 nm測定吸光值，以相同體積70%的乙醇替換樣品作空白對照，結果用DPPH自由基清除率表示。清除50%的DPPH自由基所需要的樣品質量濃度用IC50值表示。每個質量濃度測定3次，取平均值。

1.2.6 ABTS+·的清除能力測定[11]

ABTS+·溶液由10 mL ABTS溶液(7 mmol/L)和176 μL過硫酸鉀溶液(140 mmol/L)室溫避光條件下反應15 h生成，使用時用無水乙醇稀釋至溶液在 734 nm 處的吸光值為 0.70±0.02。分別取稀釋到不同質量濃度的樣品20 μL與 180 μL ABTS+·溶液于96孔酶標板中混合，避光反應 6 min后于734 nm測定吸光值，以相同體積70%的乙醇替換樣品為空白對照，結果用ABTS+·清除率表示。清除50%的ABTS+·所需要的樣品質量濃度用IC50值表示。每個質量濃度測定3次，取平均值。

1.2.7 FRAP抗氧化能力測定[15]

取稀釋到不同質量濃度的樣品10 μL與190 μL預熱至37℃的FRAP工作液于96孔酶標板中混合，避光反應30 min后于593 nm處測定吸光值，以相同體積70%的乙醇代替樣品加入FRAP工作液作為空白對照，以不同質量濃度的Trolox溶液為標樣，制作標準曲線(Y=0.004 4X+0.156 1，R2=0.997)。結果以mgTEAC/g表示。每個質量濃度測定3次，取平均值。

1.3 數據分析

采用Origin8.5軟件進行作圖，通過SPSS23.0進行IC50值的計算、差異顯著性分析與相關性分析。

2 結果與討論

2.1 活性成分含量(見表1)

表1 元寶楓翅果不同部位總酚、縮合單寧和總黃酮含量

酚類物質是植物次級代謝過程的重要產物，具有較強的抗氧化、抗菌、抗感染等作用[10]。由表1可見，種皮中總酚含量顯著高于果翅和仁粕，種皮中總酚含量最高(342.83 mgGAE/g)，其次是果翅(24.11 mgGAE/g)，仁粕中總酚含量最低(2.76 mgGAE/g)，說明元寶楓翅果中的總酚主要存在于種皮中。朱小芳等[16]對平歐榛子不同部位總酚含量進行測定，發現種皮中總酚含量也顯著高于種殼和種仁，Bravo[17]指出植物果實外皮是酚類物質的主要聚集部位，與本研究結果一致。

單寧按化學結構可分為水解單寧與縮合單寧，具有鎮靜、催眠、鎮痛、抗凝、止瀉等作用，其中縮合單寧被廣泛應用于鞣革中[1]。由表1可見，各部位間縮合單寧含量差異顯著，種皮中縮合單寧含量高達847.45 mgCE/g，果翅中縮合單寧含量為30.49 mgCE/g，僅為種皮中的3.60%，在仁粕中未檢測出縮合單寧。王性炎等[8]采用皮粉振蕩法測出元寶楓種皮中單寧含量為60.24%，果翅中單寧含量為7.87%；楊連利等[18]采用絡合法測出元寶楓種皮中單寧含量為686.10 mg/g，由此可以看出元寶楓種皮富含單寧，具有重要的開發價值。

黃酮類化合物為植物體多酚類代謝物，具有抗腫瘤、抗菌、抗炎癥、抗過敏、抗心血管疾病及抗糖尿病并發癥等藥理作用[19]。由表1可見，總黃酮含量從高到低依次為種皮(57.66 mgRT/g)>果翅(11.58 mgRT/g)>仁粕(2.48 mgRT/g)，種皮中的總黃酮含量是果翅中的4.98倍，是仁粕中的23.25倍。由此可知翅果中黃酮類化合物主要存在于種皮中，這可能是因為其暴露于外部環境中，光照、溫度、水分等條件促使其合成更多的黃酮類化合物[20]。

2.2 抗氧化能力

2.2.1 對DPPH自由基清除能力(見圖1)

由圖1可知，元寶楓翅果不同部位樣品提取物對DPPH自由基均具有一定的清除作用，在一定質量濃度范圍內清除能力隨著提取物質量濃度的增加而增加，呈現出較好的量效關系，但當各樣品提取物到達一定質量濃度后，樣品對DPPH自由基的清除率漸漸趨于平緩。以IC50值衡量翅果不同部位提取物抗氧化能力，IC50值越小，對DPPH自由基的清除能力越高，抗氧化能力越強。由圖1可知，樣品提取物IC50值大小為種皮(16.62 μg/mL)<果翅(244.52 μg/mL)<仁粕(10 110.17 μg/mL)，對照Trolox的IC50值為17.90 μg/mL，說明種皮具有最高的DPPH自由基清除能力，且高于對照Trolox，而果翅和仁粕提取物對DPPH自由基的清除能力顯著低于種皮和Trolox。

2.2.2 對ABTS+·清除能力(見圖2)

由圖2可知，元寶楓翅果不同部位樣品提取物對ABTS+·均具有良好的清除作用，但清除能力差異顯著，在一定質量濃度范圍內，ABTS+·清除率隨著樣品質量濃度的增加而增加，達到一定質量濃度后ABTS+·清除率增加得越來越慢。翅果不同部位樣品提取物IC50值從小到大依次為種皮(80.00 μg/mL)<果翅(828.03 μg/mL)<仁粕(12 431.95 μg/mL)，對照Trolox的IC50值為 57.98 μg/mL，樣品提取物對ABTS+·的清除能力均小于Trolox。種皮、果翅和仁粕的清除能力存在顯著性差異，種皮的清除能力顯著高于果翅和仁粕，這與翅果不同部位樣品提取物對DPPH自由基清除作用結果一致。

2.2.3 FRAP抗氧化能力(見表2)

表2 元寶楓翅果不同部位及對照FRAP抗氧化能力

由表2可見，果翅、種皮、仁粕均具有抗氧化活性，抗氧化能力最強的是種皮，其FRAP抗氧化能力達到了690.74 mgTEAC/g,其次是果翅，FRAP抗氧化能力為50.82 mgTEAC/g，仁粕的抗氧化能力最弱，FRAP抗氧化能力只有3.66 mgTEAC/g，種皮的FRAP抗氧化能力是果翅的13.60倍，是仁粕的188.70倍。這與DPPH自由基清除能力實驗、ABTS+·清除能力實驗得到的結果一致。

2.3 翅果抗氧化能力與3類活性成分含量相關性分析

由2.1和2.2分析可知，元寶楓翅果各部位活性成分含量從高到低為：種皮>果翅>仁粕，抗氧化能力強弱為：種皮>果翅>仁粕。總酚、縮合單寧和總黃酮均具有一定的抗氧化能力，且其含量的高低與抗氧化能力具有一定的相關性。如表3所示，元寶楓翅果不同活性成分與不同抗氧化能力評價方法之間存在著不同的相關性，樣品提取物對DPPH自由基清除作用與總酚含量和縮合單寧含量呈顯著正相關，相關系數分別為0.694和0.782，與總黃酮含量的相關系數只有0.078，說明在清除DPPH自由基的過程中，總酚和縮合單寧起著主要作用；樣品提取物中總酚含量與ABTS+·清除能力的相關系數最高，為0.930，呈顯著正相關，縮合單寧含量和總黃酮含量與ABTS+·清除能力的相關系數分別為0.467和0.649，說明在清除ABTS+·的過程中，總酚貢獻最大；樣品提取物的FRAP抗氧化能力與總酚、縮合單寧含量呈顯著正相關，3類活性成分的貢獻大小依次為總酚>縮合單寧>總黃酮。3種抗氧化能力評價結果均表明，翅果提取物中總酚與縮合單寧含量與抗氧化能力呈顯著正相關，因此推測種皮抗氧化能力強是因為其中含有大量的縮合單寧與總酚。

表3 元寶楓翅果抗氧化能力與3類活性成分含量相關性

注：*表示0.05級別(雙尾)相關性顯著，**表示0.01級別(雙尾)相關性顯著。

3 結 論

元寶楓翅果的果翅、種皮、仁粕中的3種活性成分含量和抗氧化能力存在顯著性差異，且種皮中活性成分含量最高，其總酚、縮合單寧、總黃酮含量分別為342.83 mgGAE/g、847.45 mgCE/g、57.66 mgRT/g，抗氧化能力顯著高于果翅和仁粕，具有較高的應用潛力。可將種皮進行深加工，應用于食品、保健醫藥、化妝品等行業，提高元寶楓果實的應用價值。