隴南油橄欖“賀吉”果實中主要功能成分的動態變化規律

后春靜，閆輝強，馬君義，鄧 煜，金 鳳，余嘉利，李 云，巴俊霞

(1.西北師范大學 生命科學學院， 蘭州 730070； 2.隴南市經濟林研究院 油橄欖研究所， 甘肅 武都 746000； 3.隴南市祥宇油橄欖開發有限責任公司， 甘肅 武都 746000)

油橄欖(OleaeuropaeaL.)屬于木犀科木犀欖屬常綠闊葉喬木，是世界上著名的木本油料植物，有幾千年的栽培歷史，廣泛種植于地中海國家[1]，我國甘肅、云南、四川、重慶、湖北、陜西等地多有引種栽培。油橄欖的主要產品橄欖油營養價值高、保健功能強，有預防癌癥、心腦血管疾病、糖尿病和保健、美容、烹調等功能，有“液體黃金”的美稱[2]。橄欖油的優良品質與其所含的不飽和脂肪酸、多酚、色素、黃酮、甾醇、角鯊烯等有密切關系[3]。油橄欖果實的采收時間是影響橄欖油中化合物組成及含量變化的主要因素之一，對橄欖油的產量、品質、穩定性、感官特性等有重要影響[4]。目前，我國的油橄欖產業尚處于發展階段，對于油橄欖果實中主要功能性成分在生長發育過程中的動態變化研究鮮有報道。本文以油橄欖品種“賀吉”(Hojiblanca)為研究對象，分析測定其生長發育過程中果實多酚含量、黃酮含量、含油率以及油脂中主要脂肪酸的組成與相對含量，以期闡明“賀吉”生長發育過程中主要功能性成分的動態變化規律，為確定“賀吉”(Hojiblanca)果實的最佳采摘期以及后期研究工作提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采摘地點：甘肅省隴南市油橄欖研究所種質資源基因庫(海拔1 036～1 048 m；東經104°53′30″、北緯33°24′03″；年均氣溫15.3℃，最高氣溫38.2℃、最低氣溫-7℃；年均相對濕度56.6%；年降水量468 mm，主要降水期集中于6—9月；日照時數1 871 h；土質為沙壤土，pH為7.9)。

采摘時間：2016年8月20日—2017年3月30日，每月的10、20、30日采摘油橄欖果實。

采摘品種：賀吉(Hojiblanca)。

采摘方法：從選定的油橄欖樹的上下前后左右方向各采摘10顆果實，封袋后送往實驗室，測量果形指數并清洗后放入烘箱烘干至恒重。

10種脂肪酸甲酯混標(C16～C22，美國NU-CHEK-PREP公司)，沒食子酸對照品(BW5007 壇墨質檢，純度99.9%)，蘆丁對照品(AB015R 天津一方科技有限公司，純度≥98%)；石油醚(30～60℃)、無水乙醇、甲醇、碳酸鈉、福林酚、三氯化鋁、氫氧化鈉等均為分析純；實驗用水為去離子水。

PL203型電子天平(梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司)，IKA A11基本型研磨粉碎機(德國IKA集團)，101型電熱鼓風干燥箱，SZF-06C型粗脂肪測定儀，KH7200DB型數控超聲波清洗器，RV 10B 型旋轉蒸發儀，UV 8100B型紫外-可見分光光度計，Trace 1300 ISQ型氣相色譜-質譜聯用儀(Thermo Fisher Scientific 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 橄欖油的提取

將油橄欖果實置烘箱中于50℃下烘干至恒重，研磨成細粉后，精密稱取約1.0 g細粉用濾紙包好后放入粗脂肪測定儀的抽提瓶中，加入50 mL石油醚，回流提取3 h，做3組平行實驗。

1.2.2 含油率的測定

將回流后的抽提瓶放入45℃烘箱內以除去微量的石油醚和水分，待抽提瓶冷卻后稱重，根據油脂的質量和油橄欖粉末的質量計算含油率[5]。

含油率=(m2-m1)/m×100%

式中：m為樣品質量；m1為抽提瓶質量；m2為油和抽提瓶質量。

1.2.3 “賀吉”果實多酚含量的測定

1.2.3.1 沒食子酸標準曲線的繪制與回歸方程的建立

精密稱取干燥至恒重的沒食子酸對照品0.007 8 g，用去離子水溶解，定容至50 mL容量瓶，配成156 μg/mL標準溶液。精密吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL沒食子酸標準溶液分別定容于10 mL容量瓶中，配成不同質量濃度的標準溶液。然后從各溶液中吸取0.25 mL加入10 mL容量瓶內，再加0.5 mL福林酚試劑，充分搖勻30 s后，8 min 內加入2 mL 10%的Na2CO3溶液，混勻，加去離子水定容，再混勻，然后在30℃下避光放置反應2 h，以0號樣為空白，在765 nm處測定吸光度，以吸光度(x)為橫坐標，沒食子酸質量濃度(y)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=7.374 1x-0.005(R=0.999 3)，沒食子酸質量濃度在3.12～12.48 μg/mL范圍內具有良好的線性關系。

1.2.3.2 多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu顯色法[6]，稍有改動。精密稱取油橄欖粉末約1.0 g，用石油醚除去油脂和色素，加10 mL 70%乙醇于超聲波清洗器中超聲輔助提取(時間30 min、溫度45℃、頻率28 kHz)，重復提取3次，合并提取液、過濾、旋轉蒸發、定容到10 mL容量瓶中，稀釋1倍之后，取待測液0.25 mL于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL福林酚試劑，搖勻，8 min內加入2 mL 10%的Na2CO3溶液，最后用去離子水定容至10 mL，在30℃下避光反應2 h，在765 nm處測定吸光度。依1.2.3.1回歸方程計算“賀吉”果實的多酚含量。

1.2.4 “賀吉”果實黃酮含量的測定

1.2.4.1 蘆丁標準曲線的繪制與回歸方程的建立

精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品0.016 8 g，用70%乙醇溶解，定容至100 mL容量瓶，配成0.168 mg/mL的蘆丁標準溶液。精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL和5.0 mL蘆丁標準溶液分別定容于10 mL容量瓶內，配成不同質量濃度的標準溶液。然后從各溶液中吸取3 mL加入10 mL容量瓶內，加4 mL 0.1 mol/L三氯化鋁甲醇溶液，搖勻，放置5 min，用甲醇定容至10 mL。以0號樣為空白，在410 nm處測定吸光度，以吸光度(x)為橫坐標，蘆丁質量濃度(y)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=31.096 7x-0.341 4(R=0.999 2)，蘆丁質量濃度在16.8～84.0 μg/mL范圍內具有良好的線性關系。

1.2.4.2 黃酮含量的測定

采用三氯化鋁顯色法[7]，稍有改動。精密稱取油橄欖粉末約1.0 g，用石油醚除去油脂和色素，加10 mL 70%的乙醇于超聲波清洗器中超聲輔助提取(時間30 min、溫度45℃、頻率28 kHz)，重復提取3次，合并提取液、過濾、旋轉蒸發、定容至10 mL容量瓶中。吸取3 mL待測液于10 mL容量瓶中，加4 mL 0.1 mol/L三氯化鋁甲醇溶液，充分搖勻，5 min 后用甲醇定容至10 mL。在410 nm處測定吸光度。依1.2.4.1回歸方程計算“賀吉”果實的黃酮含量。

1.2.5 “賀吉”橄欖油脂肪酸組成與相對含量的分析

1.2.5.1 脂肪酸的甲酯化

采用酯交換法[8]。精密稱取油樣約0.3 g于20 mL具塞試管中，加5 mL氫氧化鈉-甲醇溶液(0.5 mol/L)搖勻，在常溫(25℃水浴)下反應40 min，每5 min振搖1次，取出后加入5 mL的石油醚，搖勻，靜置，最后再加入5 mL的去離子水，使所有的有機相到試管頂部，用移液槍吸取上層有機相于離心管中，加無水硫酸鈉干燥，離心，過濾，稀釋10倍，進樣。

1.2.5.2 脂肪酸組成和相對含量的GC-MS分析

GC條件：AE-FFAP彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm)；載氣為99.999%的高純氦氣；進樣口溫度250℃；升溫程序為160℃保持3 min，以4℃/min的速率升至190℃，保持2 min，再以10℃/min的速率升至210℃，保持5 min，再以5℃/min的速率升至240℃，保持5 min；進樣量1 μL；進樣方式為分流進樣，分流比50∶1；載氣模式為恒流模式；載氣流速1.0 mL/min；GC-MS接口溫度250℃。

MS條件：傳輸線溫度250℃；電離方式EI；電離電壓70 eV；離子源溫度280℃；質量掃描方式為Full Scan；質量掃描范圍50～650；溶劑延遲3 min；NIST 2011版標準質譜檢索庫。

1.2.5.3 脂肪酸的定性與相對含量的測定

采用NIST 2011版標準質譜檢索庫并結合C16～C22脂肪酸甲酯混標比對分析定性，采用峰面積歸一化法計算橄欖油中各脂肪酸的相對含量。

1.2.6 數據處理與統計分析

2 結果與分析

2.1 “賀吉”果實含油率隨成熟度的動態變化

“賀吉”果實含油率隨成熟度的動態變化如圖1所示。

注：采用Duncan’s multiple range test分析方法，小寫字母代表在0.05水平下差異顯著(圖1～圖3，表1同)。

由圖1可知，在“賀吉”果實生長發育過程中含油率呈現上升趨勢，從8月20日的(14.83±0.22)%迅速增長到11月20日的(37.32±0.17)%，而后含油率出現波動，到次年3月20日含油率達到最高，為(40.92±0.57)%。期間出現波動的情況可能與該時段的日照強度以及降雨量有關。Salvador等[9]連續5年(1995—1999年)對“Cornicabra”果實含油率的研究結果顯示，其變化趨勢隨成熟度的變化先上升后稍有下降。雖然不同品種的含油率有所差異，但每個品種在成熟期的變化趨勢基本一致[10]。

2.2 “賀吉”果實多酚含量隨成熟度的動態變化

“賀吉”果實多酚含量隨成熟度的動態變化如圖2所示。

圖2 “賀吉”果實多酚含量隨成熟度的動態變化

由圖2可知，在“賀吉”果實生長發育過程中多酚含量先下降后上升。由8月20日的(7.08±0.07)mg/g下降到11月30日的(3.14±0.13)mg/g，12月20號之后又逐漸升高，于次年3月30日達到最大值(7.33±0.15)mg/g。這一實驗結果與Brigida等[10]的研究結果一致。油橄欖中主要的多酚類化合物為香草酸、橄欖苦甙、羥基酪醇、木犀草素、沒食子酸等[11-12]。多酚類物質含量被作為評價油橄欖最佳采收期的重要指標之一，主要影響橄欖油的風味、穩定性、活性功能[13]。多酚類物質的含量與品種、光照、溫度、成熟度、貯藏加工條件等因素有關。Franco等[14]研究結果表明，“Arbequina”等7個品種橄欖油中的多酚類化合物含量在果實成熟前期會有下降的現象，而且不同品種的油橄欖果實中多酚類化合物的含量和變化趨勢略有差異。

2.3 “賀吉”果實黃酮含量隨成熟度的動態變化

“賀吉”果實黃酮含量隨成熟度的動態變化如圖3所示。由圖3可知，“賀吉”果實黃酮含量的變化趨勢與多酚相似，呈現先降低后上升的變化規律。于11月30日下降到最低值(0.59±0.01)mg/g，次年3月20號升至最高含量(1.69±0.01)mg/g。油橄欖果實中主要黃酮類化合物有蘆丁、山奈酚、木犀草苷、芹菜苷、槲皮素等，具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、降血糖、防治潰瘍等作用[7]。

圖3 “賀吉”果實黃酮含量隨成熟度的動態變化

以上實驗結果表明，從含油率角度分析，建議“賀吉”果實的采摘期為11月20日—12月30日，且該時段多酚和黃酮含量較低、苦味較輕，比較符合我國消費者的口味習慣；若以出口為目的，“賀吉”果實的采摘時間則可提前至11月10日之前。

2.4 “賀吉”橄欖油脂肪酸組成和相對含量隨成熟度的動態變化

“賀吉”橄欖油脂肪酸甲酯總離子流圖如圖4所示，其脂肪酸組成及相對含量隨成熟度的動態變化如表1所示，UFA/SFA隨成熟度的動態變化如表2所示。

圖4 “賀吉”橄欖油脂肪酸甲酯總離子流圖

由表1可知，“賀吉”橄欖油中脂肪酸含量由高到低依次為油酸、棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸、亞麻酸、棕櫚油酸、花生酸、花生烯酸、十七烯酸、十七酸、山崳酸。油酸含量在次年1月10日前整體呈現上升趨勢，之后開始下降，12月10日油酸含量最高(69.61±0.16)%，10月10日含量最低，為(56.27±0.40)%。亞油酸含量整體呈現上升趨勢，8月30日含量最低，為(8.25±0.02)%、次年3月10日含量最高，為(18.59±0.04)%。棕櫚酸含量整體呈現下降趨勢，9月10日含量最高，為(20.93±0.25)%、次年3月30日含量最低，為(9.75±0.04)%。其他脂肪酸的含量在生長發育過程中變化幅度相對較小。“賀吉”果實中油酸、亞油酸、棕櫚酸含量隨成熟度的變化趨勢與Menz等[15]的研究結果一致。

在生長發育過程中飽和脂肪酸(SFA)含量整體呈現下降趨勢，最高含量為(26.08±0.20)%、最低含量為(15.95±0.08)%。單不飽和脂肪酸(MUFA)含量在12月10日之前整體處于上升趨勢，12月10日之后開始下降，最低含量為(58.44±0.40)%、最高含量為(70.91±0.17)%。多不飽和脂肪酸(PUFA)含量整體呈現上升趨勢，最高含量為(20.13±0.04)%、最低含量為(10.22±0.03)%。UFA/SFA一直處于相對穩定狀態，變化幅度小，最高值達5.24。該結果中脂肪酸含量與Angelina等[16]研究的“Koroneiki”品種的脂肪酸含量接近。不飽和脂肪酸具有預防癌癥、心臟病、高血壓的作用，橄欖油中的高含量不飽和脂肪酸對人體健康大有裨益。

3 結 論

“賀吉”果實的含油率從8月20日至11月20日上升迅速，后期上升速度減慢，最高含油率可達(40.92±0.57)%；多酚與黃酮含量呈現出先降低后升高的趨勢，最低含量分別為(3.14±0.13) mg/g和(0.59±0.01)mg/g、最高含量分別達(7.33±0.15)mg/g和(1.69±0.01)mg/g；油脂中主要脂肪酸油酸含量為(56.27±0.40)%～(69.61±0.16)%、亞油酸含量為(8.25±0.02)%～(18.59±0.04)%、棕櫚酸含量為(9.75±0.14)%～(20.93±0.25)%、亞麻酸含量為(0.94±0.01)%～(2.26±0.03)%、硬脂酸含量為(3.05±0.02)%～(7.15±0.09)%。油脂中飽和脂肪酸含量為(15.95±0.08)%～(26.08±0.20)%、單不飽和脂肪酸含量為(58.44±0.40)%～(70.91±0.17)%。綜合分析表明，11月20日—12月30日為“賀吉”果實的含油率、不飽和脂肪酸含量相對較高，多酚與黃酮含量較低的時期，橄欖油苦味清淡，符合國內消費者的口味，為“賀吉”果實的適宜采摘期。生長前期“賀吉”果實的多酚、黃酮含量相對較高的時期，橄欖油苦味較重，尤其受國外消費者的青睞，若“賀吉”單品種橄欖油為出口所用，其采摘期可提前至11月10日之前。