胃癌組織中FHIT、Bcl-2蛋白表達與幽門螺桿菌感染的關系

趙凱豐 劉慧英 江道亮 苗葉 張靜

[摘要] 目的 探討胃癌組織中脆性組氨酸三聯體（FHIT）、Bcl-2蛋白表達與幽門螺桿菌（Hp）感染的關系。 方法 收集2013年1月～2017年1月于解放軍第四六四醫院行胃癌根治術的80例胃癌組織標本，另選其中43例癌旁組織。采用快速尿素酶試紙和Warthin-Starry染色，檢測組織標本是否感染Hp，采用免疫組化染色方法檢測組織標本中FHIT和Bcl-2的表達。 結果 胃癌組織FHIT陽性表達率低于癌旁組織（P < 0.05），胃癌組織Bcl-2陽性表達率高于癌旁組織（P < 0.05）。胃癌組織中FHIT的表達與淋巴轉移、遠處轉移、分化程度、浸潤程度和Hp感染均有關（均P < 0.05），Bcl-2的表達與腫瘤直徑、分化程度、浸潤程度和Hp感染有關（均P < 0.05）。FHIT的陽性率與Hp感染呈負相關（r = -0.295，P < 0.05），Bcl-2的陽性率與Hp感染呈正相關（r = 0.393，P < 0.05）。 結論 胃癌組織中FHIT蛋白表達減弱，Bcl-2蛋白表達增強，且均與Hp感染關系密切，三者相互作用導致了胃癌的發生。

[關鍵詞] 胃癌;幽門螺桿菌;脆性組氨酸三聯體;Bcl-2

[中圖分類號] R735.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（b）-0100-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between fragile histidine triad （FHIT） and Bcl-2 protein expression in gastric cancer tissues and helicobacter pylori （Hp） infection. Methods From January 2013 to January 2017， 80 gastric carcinoma tissue samples were collected after radical gastrectomy in the 464th Hospital of PLA， and 43 paracancerous tissues were selected. Rapid urease assay paper and Warthin-Starry staining were used to detect whether the tissue samples were infected with Hp， and the expressions of FHIT and Bcl-2 in the tissue samples were detected by immunohistochemical staining. Results FHIT positive expression rate in gastric carcinoma tissues was lower than that in para-carcinoma tissues （P < 0.05）， Bcl-2 positive expression rate in gastric carcinoma tissues was higher than that in para-carcinoma tissues （P < 0.05）. The expression of FHIT in gastric carcinoma tissues was related to lymphatic metastasis， distant metastasis， degree of differentiation， degree of infiltration and Hp infection （all P < 0.05）. Bcl-2 expression was related to tumor diameter， differentiation degree， infiltration degree and Hp infection （all P < 0.05）. The positive rate of FHIT was negatively correlated with Hp infection （r = -0.295， P < 0.05）， and the positive rate of Bcl-2 was positively correlated with Hp infection （r = 0.393， P < 0.05）. Conclusion The expression of FHIT protein in gastric carcinoma tissues is weakened， and the expression of Bcl-2 protein is enhanced， which are closely related to Hp infection， and the three interactions lead to the occurrence of gastric carcinoma.

[Key words] Gastric carcinoma; Helicobacter pylori; Fragile histidine triad; Bcl-2

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國胃癌居各類惡性腫瘤發病率的首位，每年有15～20萬人死于胃癌，占全部惡性腫瘤死亡人數的25%[1]。研究顯示胃癌早期的5年生存率和10年生存率均達到90%，但大多數患者發現胃癌時已是中、晚期，此時治療的預后不佳[2]。目前手術治療是治療胃癌最好的手段，其他治療方式包括化學治療、內鏡下治療和中醫治療等[3]，但結果不甚理想。胃癌的病因尚無定論，學者廣泛認為是遺傳、飲食、環境、幽門螺桿菌（Hp）感染等多因素相互作用引起的。脆性組氨酸三聯體（fragile histidine triad，FHIT）基因是Ohta等[4]發現的一個抑癌基因，在正常組織中廣泛表達，在多種食管癌、胃癌、膀胱癌等惡性腫瘤中表達減少，喪失抑癌作用。Bcl-2是從濾泡性B淋巴細胞中分離得到的一種致癌基因，是研究最早、最深入的凋亡抑制基因，通過線粒體介導的凋亡途徑來參與腫瘤的發生[5]。目前關于Hp與FHIT和Bcl-2表達關系的研究較少，本研究對胃癌組織中FHIT、Bcl-2的表達進行檢測，并分析其與Hp感染的關系，以期為胃癌的診斷和治療提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

80例胃癌組織取自解放軍第四六四醫院于2013年1月～2017年1月期間行胃癌根治術的存檔蠟塊，其中男47例，女33例，年齡40～76歲，平均（58.3±6.5）歲。納入標準：①所有組織標本均經過病理學診斷確診為胃癌，且術前未進行放療、化療等特殊治療;②既往無胃部手術史;③1個月內無抗炎藥物、抗菌藥物、H2受體拮抗劑、質子泵抑制劑等藥物史。排除標準：①病歷資料不完全;②住院期間未接受Hp檢測者;③既往接受過Hp根除治療。另選其中43例癌旁組織（距離腫瘤邊緣>2 cm），均取自上述胃癌根治術病例。本研究經過醫院醫學倫理委員會審查。

1.2 實驗方法

1.2.1 Hp檢測? 采用快速尿素酶試紙檢測取胃黏膜組織，1～3 min內試紙由黃色變為櫻紅色為陽性，不變色者為陰性;采用Warthin-Starry染色對組織標本進行染色，陽性標本可見紅黑色或黑色弧形、S形或海鷗狀Hp，分布于胃黏膜表面黏液層、胃小凹及胃癌旁黏膜腺窩內。上述兩項檢測均呈陽性者判斷為Hp感染陽性，兩項均陰性者為無Hp感染，僅有一項陽性者不納入實驗。

1.2.2 FHIT和Bcl-2表達的檢測? 采用免疫組化染色的方法檢測組織標本中FHIT和Bcl-2表達，FHIT兔-多克隆抗體和Bcl-2兔-多克隆抗體均購自北京博奧森生物科技有限公司。先將固定后的組織標本在60℃恒溫烤箱中烤干1 h，室溫冷卻后進行脫水處理，用3%過氧化氫（H2O2）滅活內源性酶，再用乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修復液修復抗原，PBS沖洗后滴加BSA封閉液，孵育10 min添加一抗，4℃冰箱孵育18 h，添加二抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗2～3次，加二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液顯色10 min，蘇木精復染30 s，梯度酒精脫水，中性樹膠封片，室溫晾干，鏡下觀察。

1.2.3 染色結果判定? FHIT和Bcl-2蛋白陽性表達定位均位于細胞質，選已知陽性的組織切片為陽性對照，用PBS替代一抗作陰性對照。結果采用雙盲半定量積分法，每張切片的染色結果由2名病理醫師分別確認：①按細胞著色深淺程度評分：無著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，黃褐色為3分;②按陽性細胞所占比例評分，每張切片隨機計數10個視野中的陽性細胞百分比，選擇高倍鏡（400×）視野，避開邊緣組織。百分比<5%為0分，5%≤百分比<25%為1分，25%≤百分比<50%為2分，百分比≥50%為3分;③將上述2項得分相加得到綜合評分，綜合得分≥4分判定為陽性（+），綜合得分<4分判定為陰性（-）。

1.3 統計學方法

所有數據均采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FHIT和Bcl-2在癌組織與癌旁組織中的表達

癌旁組織、胃癌組織FHIT蛋白的陽性表達率依次為62.79%、42.50%，胃癌組織陽性表達率低于癌旁組織（P < 0.05）。見圖1（封四）、表1;癌旁組織、胃癌組織Bcl-2蛋白的陽性表達率依次為39.53%、63.75%，其中胃癌組織陽性表達率高于癌旁組織（P < 0.05）。見圖2（封四）、表1。

2.2 FHIT和Bcl-2的表達與臨床參數的關系

胃癌組織中FHIT的表達與淋巴轉移、遠處轉移、分化程度、浸潤程度和Hp感染均有關（均P < 0.05），與年齡、性別、腫瘤直徑無關（均P > 0.05）;Bcl-2的表達與腫瘤直徑、分化程度、浸潤程度和HP感染有關（均P < 0.05），與年齡、性別、淋巴轉移、遠處轉移等臨床特征無關（均P > 0.05）。見表2。

2.3 相關性分析

FHIT的陽性率與Hp感染呈負相關（r = -0.295，P < 0.05）;Bcl-2的陽性率與Hp感染呈正相關（r = 0.393，P < 0.05）。

3 討論

胃癌的明確病因尚不清楚，但自從Hp被發現以來，大量研究報道均顯示其參與了胃癌發生過程[6-8]，鑒于這些研究結果國際癌癥研究中心（IARC）在1994年將Hp定義為Ⅰ類致癌原[9-10]。Watanabe等[11]將Hp接種至5周齡的蒙古沙鼠，成功觀察到了炎癥細胞浸潤、萎縮性胃炎、腸上皮化生和不典型增生的過程，并成功誘導胃癌，證實Hp在胃癌的發生中的作用。Hp感染與癌基因激活、抑癌基因沉默三者相互作用引起胃黏膜上皮細胞異常增生是胃癌發生的重要原因。

FHIT是一種新發現的抑癌基因，全長1095 bp，編碼FHIT蛋白，是一種典型的Ap3A水解酶，Ap3A是ATP類似物，具有抑制蛋白激酶活性的作用，當FHIT蛋白活性降低時，Ap3A水平升高引起生長信號傳導途徑增強，阻斷凋亡通道，導致腫瘤的發生[12-13]。FHIT蛋白還作用于mRNA帽類似物，可能通過影響關鍵基因mRNA的翻譯發揮抑癌作用[14]。雖然目前尚不清楚FHIT究竟通過何種途徑發揮抑癌作用，但是大量研究均表明其在胃癌的發生過程中發揮了重要作用，Baffa等[15]發現67%的原發性胃腺癌患者FHIT基因缺失或表達減少，Huiping等[16]利用RT-PCR技術對39例胃癌組織中FHITmRNA的表達進行分析，發現87.18%的標本存在FHIT低表達。本研究對組織標本進行免疫組化染色結果顯示，癌旁組織、胃癌組織FHIT蛋白的陽性表達率分別為62.79%、42.50%，且胃癌組織陽性表達率低于癌旁組織（P < 0.05），提示FHIT蛋白表達降低或缺失與胃癌的發生存在密切關系。FHIT與患者臨床特征的分析結果顯示，在有淋巴結轉移、有遠處轉移、分化程度低、浸潤程度高和Hp感染的胃癌組織中，FHIT的表達顯著減少，提示FHIT蛋白在胃癌的發生、發展、轉移過程中均發揮重要作用，與Rocco等[17]研究結果一致。

Bcl-2是濾泡性B淋巴細胞中分離得到的一種癌基因，正常位于18號染色體上，在淋巴瘤中易位到14號染色體上[18]。Bcl-2基因被稱作存活基因，其編碼的蛋白質定位于線粒體內膜、核周膜和內質網上，通過抑制Casepase酶系和阻礙細胞色素C的釋放[19]，阻礙凋亡途徑，增強細胞對凋亡刺激因子的耐受力[20]。在體內Bcl-2與Bax基因的比例決定了細胞凋亡程度，當Bcl-2表達增加時，與Bax形成二聚體，凋亡被抑制，當Bax表達增加時，可拮抗Bcl-2的作用使細胞凋亡[21]。本研究結果顯示，癌旁組織、胃癌組織Bcl-2蛋白的陽性表達率依次為39.53%、63.75%，胃癌組織陽性表達率高于癌旁組織（P < 0.05），與劉海峰等[22]的研究結果一致。Bcl-2與臨床特征的比較結果顯示，分化程度低、浸潤程度高、腫瘤直徑大和Hp感染組織中表達顯著增高，Jr等[23]也發現Hp（+）胃癌組織中Bcl-2表達水平更高。本研究結果還顯示，FHIT的陽性率與Hp感染呈負相關（r = -0.295，P < 0.05），Bcl-2的陽性率與Hp感染呈正相關（r = 0.393，P < 0.05），提示胃癌發生過程中，FHIT表達降低，Bcl-2表達增強，引起細胞異常增生，抵抗凋亡作用，導致腫瘤形成，而Hp感染可能作為一個重要因素引發了這一過程，其作用機制有待進一步研究確認。

綜上所述，胃癌組織中FHIT蛋白表達減弱，Bcl-2蛋白表達增強，且均與Hp感染關系密切，三者相互作用導致了胃癌的發生。

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（收稿日期：2018-06-01? 本文編輯：封? ?華）