臺州地區兒童肺炎支原體感染及23S rRNA突變情況的多中心調查

應小明 王麗珍 鄭昌華 楊善浦

[摘要] 目的 了解臺州地區兒童急性呼吸道感染中肺炎支原體（MP）的感染情況及其對大環內酯類藥物耐藥情況。 方法 在臺州市第一人民醫院、臺州醫院、溫嶺市第一人民醫院和玉環人民醫院4家醫院兒科2016年1月～2017年12月進行多中心調查，共收集4395例0～14歲急性呼吸道感染患兒的呼吸道標本，采用Real-time PCR法檢測MP陽性率及耐藥基因（23S rRNA）的突變情況，并對臨床資料進行統計分析。 結果 Real-time PCR結果顯示，在4395例急性呼吸道感染患兒中，MP感染742例，感染率為16.88%，其中有422例23S rRNA突變，突變率為56.87%。不同季節MP感染率比較，差異有統計學意義（P < 0.05），夏季最高為23.56%;不同年齡組間MP感染率比較，差異有統計學意義（P < 0.05），且隨著年齡的增長而升高;不同性別患兒MP陽性率比較，差異無統計學意義（P > 0.05）;不同季節、不同性別患兒23S rRNA突變率比較差異無統計學意義（P > 0.05）;不同年齡患兒23S rRNA突變率比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 多中心聯合研究結果顯示，MP感染可能與氣候、年齡相關，MP感染夏季多發，大齡兒童多見，同時，MP對大環內酯類藥物的耐藥率較高。

[關鍵詞] 肺炎;肺炎支原體;耐藥;患兒;多中心

[中圖分類號] R725.6? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（b）-0038-04

[Abstract] Objective To know about the infection conditions of Mycoplasma pneumonia （MP） and conditions of drug resistance to macrolides of children with acute respiratory infection in Taizhou region. Methods Through multicenter investigation of pediatric departments in the 4 hospitals of Taizhou First People′s Hospital， Taizhou Hospital of Zhejiang Province， the First People′s Hospital of Wenling and the People′s Hospital of Yuhuan， the respiratory tract samples of 4395 cases of children with acute respiratory infection were collected from January 2016 to December 2017. Real-time PCR was used to detect the positive rates of MP and the mutations of its drug resistance gene （23S rRNA）. Then the clinical data was analyzed. Results The results of Real-time PCR showed that among 4395 children with acute respiratory infection， 742 cases were MP positive， the infection rate was 16.88%， among whom， there were 422 cases of mutation of 23S rRNA， the mutation rate was 56.87%. There was statistically significant difference of the positive rates of MP among different seasons （P < 0.05）， among which， summer （23.56%） was the highest. There was statistically significant difference in the positive rates of MP among different age groups （P < 0.05）， and it increased with age. There was no significant difference in infection rate of MP between children of different sexes （P > 0.05）; there was no significant difference in mutation rate of 23S rRNA among children of different seasons and sexes （P > 0.05）; and there was statistically significant difference in mutation rate of 23S rRNA among children of different ages （P < 0.05）. Conclusion This multicenter combining research shows that MP infection may have correlation with climate and age. MP infection is more common in summer and older children. At the same time， MP has higher drug resistance rates for macrolides.

[Key words] Pneumonia; Mycoplasma pneumonia; Drug resistance; Children; Multicenter

近年發現由肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）引起的兒童難治性肺炎呈逐漸增多的趨勢，其原因部分歸于MP耐藥[1-2]。同時，在臨床上耐藥MP感染與混合感染二者引起的肺炎比較難區分，給實際診治工作帶來了困難[3]。由MP所引起的肺炎及其肺外并發癥（如腦膜炎、心肌炎和腎炎等）對小兒健康造成了嚴重傷害[4]。鑒于兒童處于特殊的生長發育時期，兒童感染MP首選大環內酯類藥物來進行治療[5]。然而，近年來MP對大環內酯類的耐藥性越來越強，主要是藥物靶位改變導致的，尤其是23S rRNA基因突變[6]。不同地區MP對大環內酯類的耐藥率差異較大，我國該種耐藥情況比較嚴重，近年來部分地區MP對大環內酯類的耐藥率甚至還在不斷上升[7]。為了解當前臺州地區兒童MP的感染情況及其對大環內酯類抗菌藥物的耐藥情況，本研究對臺州地區的4家醫院進行了一項多中心研究，現報道如下：

1 對象與方法

1.1 研究對象

依據《諸福棠實用兒科學》第7版臨床診斷標準[8]，選取2016年1月～2017年12月臺州市第一人民醫院、臺州醫院、溫嶺第一人民醫院、玉環人民醫院4所醫院臨床診斷為急性呼吸道感染的門診及住院患兒作為研究對象。納入標準：①符合診斷標準;②年齡0～14歲;③有完整的臨床資料。排除標準：①免疫功能異常者;②既往重癥肺炎未痊愈者;③合并結締組織疾病者。本研究經4所醫院醫學倫理委員會批準備案。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器? H2100R臺式高速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）;T100 PCR擴增儀[Bio-Rad Laboratories（Shanghai）Co.，Ltd];HB-100型電熱恒溫水槽（徐州淮博儀器設備有限公司）;邁瑞MR-96A酶標儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）;Milli-Q純水系統[默克化工技術（上海）有限公司]。耐藥突變位點檢測試劑盒（江蘇默樂生物科技股份有限公司，國械注準：20143402242，生產批號：2016071321、201708 2172）;MP快速液體培養基（北京聯立信生物技術有限公司）。

1.2.2 標本采集? 在入院24 h內采集所有患兒2 mL外周血（用于MP抗體檢測），同時采用無菌咽拭子采集患兒咽部分泌物（用于培養基培養及耐藥性檢測）。

1.2.3 檢測方法? ①DNA提取，在咽拭子樣本管中加入2 mL生理鹽水，置于振蕩器上使其充分混勻;取相應數量的2.5 mL離心管，將混勻的樣品逐個加入其中，待高速離心（轉速15 000 r/min，離心半徑為12 cm）10 min后吸去上清液，同時保留底部細胞沉淀，將50 μL裂解液和5 μL內標液加入EP管中;EP管置于漩渦混合器上充分混勻，高溫金屬浴10 min（100℃）;待冷卻至室溫后又高速離心10 min，所得上清液即為DNA模板。②DNA擴增，上游引物序列：5′-AGGCTGAGTACTGCCCAAGAG-3′，下游引物序列：5′-CAACTGGAGCATAAGAGGTGT-3′。在生物安全柜中將提取的5 μL DNA模板、5 μL陰性對照和5 μL質控品分別加入相應編號的反應液中，短暫離心后通過傳遞窗傳遞至擴增區。PCR參數：98℃，2 min;95℃，10 s;72℃，1 min，40個循環，64℃延伸10 min。熒光信號的收集定為FAM（2063或2064A∶G突變）、VIC（肺炎支原體）和CY5（內標），64℃延伸結束后，采集上一個循環的熒光信號。③結果判定：反應結束后，儀器自動保存結果（以Ct值顯示）。Ct值20.00～25.00為強陽性對照的目的基因;Ct值29.00～34.00為弱陽性對照的目的基因;Ct值≤35.00為內標。采用FAM熒光指示23S rRNA耐藥突變，采用VIC熒光指示肺炎支原體，結果判讀標準見表1。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件對數據進行統計處理，感染率、突變率等定性數據以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MP感染及23S rRNA突變情況

共入選4395例患兒，其中男2545例，女1850例。有742例MP感染，感染率為16.88%（742/4395），其中23S rRNA突變422例，突變率為56.87%（422/742）。

2.2 不同季節患兒MP感染及23S rRNA突變情況比較

根據季節將患兒分為4組，分別為春季組（3～5月）、夏季組（6～8月）、秋季組（9～11月）、冬季組（12～2月），其中夏季組的感染率最高為23.56%，MP感染率與季節有顯著的相關性（P < 0.05），23S rRNA突變與季節間不存在相關性（P > 0.05）。見表2。

2.3 不同年齡患兒MP感染及23S rRNA突變情況比較

根據患兒的年齡將其分為4組，分別為<1歲組、1～3歲組、>3～6歲組、>6～14歲組。不同年齡組間患兒的MP感染率在5.21%～33.19%之間，與年齡存在一定相關性（P < 0.05），隨著年齡的增長，患兒MP陽性率呈上升趨勢;不同年齡組間患兒23S rRNA突變率在50.75%～66.95%之間，也與年齡存在一定的相關性（P < 0.05）。見表3。

2.4 不同性別患兒MP感染及23S rRNA突變情況比較

根據患兒性別將其分為男性組及女性組，MP陽性率分別為16.03%和18.05%，兩組比較差異無統計學意義（P > 0.05）;突變率分別為58.82%和54.49%，兩組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表4。

3 討論

近年來，肺炎支原體肺炎的發病率有所上升，并且進行治療的大環內酯類藥物耐藥也有所增加[9]。以往認為MP對大環內酯類藥物敏感性高，2001年日本首次報道大環內酯類抗生素耐藥MP株后，引起了普遍關注，并逐漸成為研究熱點[10]。有研究表明，感染耐藥MP患兒的臨床過程明顯長于感染敏感MP的患兒，且抗生素的用藥療程或更換頻率要遠遠高于感染敏感MP的患兒，推測其臨床療效欠佳可能與MP耐藥株增多有關[11]。

本研究多中心收集的4395例急性呼吸道感染兒童咽拭子檢測MP陽性率為16.88%，高于寶雞地區的12.1%[12]。患兒性別則與感染率無相關性。MP感染主要通過呼吸道，在我國各個季節均可發病，但不同地區有所差異（北方以冬季為主，而南方以夏秋季為主）[13]，本研究結果顯示夏季感染率最高為23.56%，對臺州地區夏季預防MP肺炎有一定的指導意義。廣州、蘇州、北京等地區的研究結果均報道MP感染率隨著年齡的增長而增加[14-16]，與本研究結果一致，本研究結果顯示，>6～14歲組MP感染率最高（33.19%）。這可能與>6～14歲組兒童日常所處的環境軌跡有關，這一年齡段的兒童已經上學，大部分時間為集體生活學習，所處環境人口密度相對較高，這可能增加了交叉感染的機會。

MP耐藥菌株的出現對臨床治療是一項嚴峻的挑戰。既往研究顯示，我國MP分離菌株對大環內酯類藥物的耐藥率高于70%[17-19]。本研究結果顯示，在MP感染陽性標本中，23S rRNA基因位點突變率較高（56.87%），表明臺州市兒童感染的MP對大環內酯類藥物耐藥，應當引起特別重視。Real-time PCR法具有敏感性高、特異性強的特點，可快速提供MP感染的診斷，且可以檢測耐藥基因突變情況，也可指導如何有效使用抗菌藥，有利于對MP進行早期診斷，提示臨床優化治療方案[20]。

大環內酯類藥物具有口服后吸收好、組織中濃度高、毒副作用較低、適用于兒童等特點[21-23]，在未來臨床上仍將是兒童常用治療支原體肺炎的主要抗生素。因此在臨床中需進一步加強兒童大環內酯類藥物耐藥性的監測，加大監管力度，保證大環內酯類藥物的規范合理使用，有效遏制其耐藥性的擴大。臨床如遇MP發生耐藥的情況，可以考慮聯合使用廣譜抗生素以達到抗感染的目的，此外中藥也是有效控制MP感染或耐藥MP感染的方法之一[24]。

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（收稿日期：2018-10-05? 本文編輯：羅喬荔）