低氧耐性胃癌細胞系的建立及生物學特征分析

車曉芳 師霄楠 鄭春雷 楊子長 張曉潔 曲秀娟 劉云鵬

[摘要] 目的 建立低氧耐性胃癌細胞系，并分析其生物學特征，為胃癌低氧微環境研究提供良好的模型。 方法 通過逐漸降低氧氣濃度建立耐受2%O2的低氧耐性胃癌細胞系MGC803/hypo和BGC823/hypo。采用倒置顯微鏡觀察細胞形態;采用Transwell小室檢測細胞遷移能力;采用MTT法檢測細胞增殖能力;采用免疫印跡法檢測其蛋白表達;比較其與親本胃癌細胞系的生物學特征差異。 結果 與親本胃癌細胞系比較，低氧耐性胃癌細胞系呈梭形改變，且排列松散，培養液顏色易變黃，遷移能力明顯增強（P < 0.05），增殖能力減弱（P > 0.05）;低氧相關指標HIF-2α明顯上調，糖酵解相關指標Glut1顯著上調，上皮間充質轉化（EMT）相關指標ZO-1下調，vimentin上調;轉移相關指標MUC1、integrin α5、integrin β1上調。 結論 本研究建立了可耐受2%O2濃度的低氧耐性胃癌細胞系MGC803/hypo和BGC823/hypo，其轉移能力明顯增強，增殖能力相對減弱，這為探索低氧微環境促進腫瘤轉移機制建立了良好的模型。

[關鍵詞] 胃癌細胞系;低氧耐性;生物學特征;轉移能力;增殖能力

[中圖分類號] R735.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（b）-0014-05

[Abstract] Objective To establish a hypoxic-resistant gastric cancer cell line and analyze its biological characteristics to provide a good model for the study of hypoxic microenvironment in gastric cancer. Methods The hypoxic-resistant gastric cancer cell lines MGC803/hypo and BGC823/hypo， which were tolerant to 2% O2， were established by gradually decreasing the oxygen concentration. The morphology of the cells was observed by inverted microscope. The cell metastasis ability was detected by Transwell chamber. The cell proliferation ability was detected by MTT assay. The protein expression was detected by Western blot. The biological characteristics of the gastric cancer cell lines were compared with those of their parents. Results Compared with the parental gastric cancer cell line， the hypoxic-resistant gastric cancer cell line showed spindle-shaped changes and loosely arranged. The color of the culture medium was easy to turn yellow， the migration ability was significantly enhanced （P < 0.05）， and the proliferation ability was weakened （P > 0.05）. Hypoxia-related index HIF-2α was significantly up-regulated， Glut1 was up-regulated in glycolytic index， ZO-1 was down-regulated in epithelial mesenchymal transition （EMT）， vimentin was up-regulated， and metastasis-related indicators MUC1， integrin α5， and integrin β1 were up-regulated. Conclusion This study established hypoxic-resistant gastric cancer cell lines MGC803/hypo and BGC823/hypo which can tolerate 2% O2 concentration. The Metastasis ability is obviously enhanced and the proliferative ability is relatively weakened. This provides a good model for exploring the mechanism of hypoxic microenvironment promoting tumor metastasis.

[Key words] Gastric cancer cell line; Hypoxia-resistance; Biological characteristics; Metastasis ability; Proliferation ability

我國胃癌發病率在各類腫瘤中位居第二位，每年因胃癌死亡的人數約20余萬[1]，約占世界胃癌死亡人數的一半。75%的胃癌患者發現時已是晚期，其預后極差。轉移是導致胃癌患者死亡的主要原因之一，而低氧微環境在腫瘤轉移過程中發揮著重要的促進作用。然而，目前大多數腫瘤低氧微環境的相關研究中，其腫瘤細胞通常暴露于0.1%～1%的O2條件下培養24～72 h[2]。這種短期、急性低氧處理并不能完全反映腫瘤內部的真實情況，且常規培養的腫瘤細胞在體外低氧條件下僅能存活幾天，嚴重限制了腫瘤低氧微環境的深入研究。為更真實地模擬腫瘤低氧微環境，本研究利用逐漸降低O2濃度的方法建立低氧耐性胃癌細胞系，并比較親本胃癌細胞和低氧耐性胃癌細胞的基本生物學特性異同。以期為胃癌低氧微環境研究提供良好的模型。

1 材料與方法

1.1 試劑

RPMI1640、DMEM培養基（均購自Gibco公司）、胎牛血清（購自Biological Industries公司）HIF-1α、HIF-2α、Glut1、ZO-1、vimentin、MUC1、integrinα5、integrinβ1、β-actin抗體（購自Santa Cruz公司或Cell Signaling Technology公司）、羊抗鼠和羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗（購自北京中杉金橋生物技術有限公司）、ECL檢測試劑盒（購自PIERCE公司）。

1.2 細胞培養

人胃癌細胞系MGC803和BGC823購自國家細胞資源庫，37℃、5%CO2條件下培養于含10%胎牛血清（FBS）、青鏈霉素各100 U/mL的RPMI 1640培養液中，2～3 d傳代1次，取對數生長期的胃癌細胞用于實驗。

1.3 低氧耐性胃癌細胞系的建立

通過逐步降低O2濃度的方法建立低氧耐性胃癌細胞系MGC803/hypo和BGC823/hypo（圖1）。親本胃癌細胞MGC803和BGC823依次培養于10%、5%O2濃度條件下，篩選活細胞繼續培養1個月;最后將O2濃度降低至2%，篩選活細胞培養2個月，至完全適應2%O2低氧狀態。已建立的低氧耐性胃癌細胞系MGC803/hypo和BGC823/hypo在37℃、5%CO2和2%O2條件下常規培養于含10%FBS、青鏈霉素各100 U/mL的DMEM培養液中。

1.4 細胞形態觀察

在倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

1.5 細胞遷移實驗

取對數生長期的胃癌細胞，制備成1×105個/mL的細胞懸液。細胞遷移（Transwell）小室的下室加入500 μL含2.5% FBS的培養液，上室加入200 μL細胞懸液，繼續培養24 h后，取出小室，吉姆薩（Giemsa）染色40 min，顯微鏡下觀察并計數遷移至小室下層的細胞個數。實驗重復3次。

1.6 MTT法測定細胞增殖能力

取對數生長期的胃癌細胞，制備成1×105個/mL的細胞懸液。調整細胞濃度3000個/孔，接種于96孔板中，分別培養24、48、72、96 h，其后每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，培養4 h，吸凈上清，每孔加入200 μL二甲基亞砜（DMSO），震蕩10 min，采用酶標儀于570 nm處測定其吸光值。

1.7 蛋白質免疫印跡測定蛋白表達

利用細胞裂解液將胃癌細胞裂解，其后進行蛋白定量。取20 μg蛋白樣本，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行電泳分離;轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜后，室溫封閉1 h;一抗孵育4°C過夜;TBST洗4次，每次10 min;二抗室溫孵育1 h，TBST洗4次，增強化學發光法（ECL）顯色。

1.8 統計學方法

所有數據均為3次獨立實驗結果。采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 低氧耐性胃癌細胞的形態改變

倒置顯微鏡觀察下低氧耐性胃癌細胞和親本胃癌細胞的形態。與親本胃癌細胞系比較，低氧耐性胃癌細胞系呈梭形改變、且排列松散，提示低氧耐性胃癌細胞發生了上皮間充質轉化（EMT）樣改變（圖2）。

2.2 低氧耐性胃癌細胞培養液改變

培養皿中分別接種相同數量的親本胃癌細胞和低氧耐性胃癌細胞，培養3 d后觀察培養液顏色，可見低氧耐性胃癌細胞培養液更易變黃，呈酸性，提示低氧耐性胃癌細胞糖酵解能力增強。見圖3（封三）。

2.3 低氧耐性胃癌細胞的遷移能力改變

Trnaswell小室法比較親本胃癌細胞和低氧耐性胃癌細胞的遷移能力改變，發現與親本胃癌細胞比較，穿過Transwell小室的低氧耐性胃癌細胞數量明顯增加，提示低氧耐性胃癌細胞遷移能力明顯增強（圖4）。

2.4 低氧耐性胃癌細胞的增殖能力變化

低氧耐性胃癌細胞的增殖速率比親本胃癌細胞慢，但差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖5。

2.5 低氧耐性胃癌細胞的蛋白表達改變

與親本胃癌細胞比較，低氧耐性胃癌細胞中HIF-2α明顯升高，提示長期低氧條件下，HIF-2α可能對轉錄起著重要的調節作用;Glut1明顯上調，提示長期低氧增加了胃癌細胞的糖攝取和糖酵解能力（圖6A）。上皮表型標志物ZO-1下調，而間質表型標志物vimentin明顯上調，進一步證明低氧耐性胃癌細胞發生了EMT樣改變;與轉移相關的MUC1、integrin α5、integrin β1的表達明顯增加，提示長期低氧誘導的MUC1、integrin α5、integrin β1等促進了低氧耐性胃癌細胞轉移（圖6B）;另外，G1期相關蛋白cyclinD1和cyclinE在低氧耐性胃癌細胞中明顯下調，而cyclinA和cyclinB1無明顯變化，提示長期低氧條件下cyclinD1和cyclinE下調可能通過減慢G1期導致胃癌細胞增殖能力減弱（圖6C）。

3 討論

腫瘤微環境在腫瘤發生進展中發揮著不可忽視的作用[3]，而缺氧是包括胃癌在內的實體瘤微環境的關鍵特征之一[4]。隨著腫瘤細胞的快速增殖，腫瘤局部耗氧量增加，使腫瘤細胞處于乏氧狀態。雖然代償性血管新生可部分恢復腫瘤細胞氧供，但由于新生血管結構和功能異常，不能滿足腫瘤進一步生長所需，使其再次處于乏氧狀態[5-6]。如此反復，腫瘤細胞在高度乏氧和中度乏氧狀態間波動，直到適應這種循環性低氧微環境。因此，本研究中通過逐步降低O2濃度建立的可耐受2%O2濃度的低氧耐性胃癌細胞MGC803/hypo和BGC823/hypo，更能真實反映腫瘤的低氧微環境，更有助于深入探討低氧微環境促進胃癌轉移的機制。

既往研究[7]認為，HIF-1α是細胞適應低氧環境的主要轉錄因子。在正常氧氣濃度下，細胞中HIF-1α與E3泛素連接酶（VHL）結合后導致泛素化降解，故其在細胞中的表達水平很低;而在低氧情況下，HIF-1α因不能與VHL結合導致降解受抑而穩定表達，入核后與HIF-1β形成復合物，并結合至靶基因的缺氧反應元件（HRE），促進靶基因的轉錄，調節細胞增殖、轉移和血管生成等過程[8-11]。然而，在長期缺氧條件下，通常HIF-1α并不增高，而是HIF-2α蛋白穩定表達[12]。HIF-2α調控的靶基因除部分與HIF-1α相同外，有其特異性靶基因，且大部分靶基因尚不明確。因此，HIF-1α可能主要參與癌癥的早期階段，而HIF-2α主要參與晚期階段[13]。在本研究中，與親本胃癌細胞比較，低氧耐性胃癌細胞HIF-2α明顯上調，而非HIF-1α，提示長期低氧時HIF-2α發揮著非常重要的作用。HIF-2α如何參與低氧微環境促進胃癌轉移還需深入研究。

與親本胃癌細胞比較，本研究中低氧耐性胃癌細胞轉移能力明顯增強，且發生了EMT樣的改變。缺氧時HIF-1可通過上調EMT轉錄因子Snail[14]、TWIST[15]、ZEB[16]和SLUG[17]等的表達誘導EMT的發生。EMT是腫瘤轉移的關鍵過程。此外，本研究中低氧耐性胃癌細胞增殖減慢，且cyclinE和cyclinD1表達明顯降低，提示長期低氧可能通過降低細胞周期調控蛋白表達抑制增殖。缺氧可以抑制多種腫瘤細胞的增殖[18-19]，HIF-1α可通過影響MYC的活性誘導p21和p27基因轉錄[20]，HIF-1α和HIF-2α都直接結合細胞分裂周期蛋白6（Cdc6）而導致DNA復制減少，抑制細胞周期進程[18]。另外，低氧耐性胃癌細胞中Glut1、MUC1、integrin α5和integrin β1均明顯上調，提示低氧微環境促進腫瘤轉移是非常復雜的過程，除EMT外，糖酵解、細胞外基質重塑等因素也參與其中。長期低氧促進胃癌轉移的具體機制還有待于進一步深入研究。

綜上所述，本研究建立的低氧耐性胃癌細胞系代謝更快、轉移能力更強、更具間質表型，可更加真實地反映體內腫瘤低氧微環境，為以后低氧微環境促進胃癌細胞轉移的研究提供了重要的模型。

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（收稿日期：2018-07-09? 本文編輯：王? ?蕾）