甲亢源性心房顫動與心房交感神經重構相關的發病機制研究

鄭甲林 代華磊 張新金 李建美

[摘要] 目的 研究甲亢源性房顫與心房交感神經重構相關的發病機制。 方法 選取50只成年健康日本大耳兔，按照隨機數字表法分為給藥2月組（n = 20）、給藥4月組（n = 20）、對照組（n = 10）。給藥2月組每日腹腔內注射甲狀腺素50 μg/kg，持續2個月;給藥4月組每日腹腔內注射甲狀腺素50 μg/kg，持續4個月;對照組每日腹腔內注射等劑量生理鹽水，持續4個月。制備甲亢房顫易患動物模型，比較三組基礎資料、左心房有效不應期（LAERP）、房顫誘發率，以及交感神經激活和重構相關指標的表達情況。 結果 ①實驗后，給藥2月組和給藥4月組體重低于對照組，且給藥4月組體重低于給藥2月組（P < 0.05）;給藥2月組和給藥4月組心率快于對照組（P < 0.05）。②給藥2月組、給藥4月組的LAERP均短于對照組，且給藥4月組短于給藥2月組（P < 0.05）。③給藥4月組的房顫誘發率高于給藥2月組和對照組（P < 0.05）。④給藥2月組和給藥4月組去甲腎上腺素水平高于對照組（P < 0.05）。⑤給藥2月組、給藥4月組酪氨酸羥化酶（TH）和生長相關蛋白-43（GAP-43）的mRNA相對表達量高于對照組（P < 0.05），且給藥4月組GAP-43 mRNA相對表達量高于給藥2月組（P < 0.05）。⑥給藥2月組、給藥4月組TH和GAP-43蛋白相對表達量高于對照組（P < 0.05），且給藥4月組GAP-43蛋白相對表達量高于給藥2月組（P < 0.05）。 結論 持續高水平甲狀腺素暴露下心房交感神經被過度激活、重構，其可能是甲亢源性心房顫動的發病機制之一。

[關鍵詞] 心房顫動;甲亢;交感神經;重構

[中圖分類號] R541.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（b）-0009-06

[Abstract] Objective To study the pathogenesis of hyperthyroidism-induced atrial fibrillation and atrial sympathetic nerve remodeling. Methods According to random number table method， 50 adult healthy Japanese big ear rabbits were divided into two month administration group （n = 20）， four month administration group （n = 20） and control group （n = 10）. The two month administration group received intraperitoneal injection of thyroxine 50 μg/kg daily for 2 months， the four month administration group received intraperitoneal injection of thyroxine 50 μg/kg daily for 4 months， and the control group received intraperitoneal injection of equal dose of normal saline for 4 months. Animal models of hyperthyroidism and atrial fibrillation vulnerability were prepared. The basic data， left atrial effective refractory period （LAERP）， induced rate of atrial fibrillation， and expression of related indicators of sympathetic nerve activation and remodeling were compared among the three groups. Results ①After the experiment， the body weight of two month administration group and four month administration group were lower than those of control group， and the body weight of four month administration group was lower than that of two month administration group （P < 0.05）; the heart rate of two month administration group and four month administration group were faster than those of control group （P < 0.05）. ②The LAERP in the two month administration group and four month administration group were shorter than those in the control group， and that in the four month administration group was shorter than that in the two month administration group （P < 0.05）. ③The induced rate of atrial fibrillation in the four month administration group was higher than that in the two month administration group and the control group （P < 0.05）. ④The level of norepinephrine in the two month administration group and the four month administration group were higher than those in the control group （P < 0.05）. ⑤The relative expression of tyrosine hydroxylase （TH） and growth associated proteins-43 （GAP-43） mRNA in the two month administration group and four month administration group were higher than those in the control group （P < 0.05）， and the relative expression of GAP-43 mRNA in the four month administration group was higher than that in the two month administration group （P < 0.05）. ⑥The relative expression of TH and GAP-43 protein in the two month administration group and four month administration group were higher than those in the control group （P < 0.05）， and the relative expression of GAP-43 protein in the four month administration group was higher than that in the two month administration group （P < 0.05）. Conclusion Atrial sympathetic nerve is overactivated and remodeled under continuous high level of thyroxine exposure， which may be one of the pathogenesis of hyperthyroidism-induced atrial fibrillation.

[Key words] Atrial fibrillation; Hyperthyroidism; Sympathetic nerve; Remodeling

甲狀腺功能亢進（甲亢）與心血管疾病，尤其是心房顫動（房顫）有顯著的關聯性[1-2]。甲狀腺激素受體位于細胞核，一般認為甲狀腺激素通過與其受體結合實現對靶基因的直接調節[3-4]。而有研究發現，甲狀腺激素還可激活其他系統如交感神經系統，間接作用于靶器官[5]。甲亢引起心臟損害部分依賴于交感神經興奮，而交感神經與心律失常，尤其是與房顫密切相關[6-7]。因此，甲亢激活交感神經可能是房顫發生的原因之一。國內外對交感神經參與甲亢源性房顫的相關研究甚少，具體機制尚未闡明。本研究通過建立兔甲亢房顫易患模型，檢測去甲腎上腺素、左心房交感神經重構標志物酪氨酸羥化酶（TH）、生長相關蛋白（GAP-43）的基因及蛋白表達水平，從而明確甲亢源性心房顫動與左心房交感神經相關的發病機制，為臨床治療甲亢源性房顫患者提供部分新的理論依據。

1 材料與方法

1.1? 實驗材料

1.1.1 動物? 50只成年健康日本大耳兔[使用許可證號：SYXK（滇）K2013-0011]，由昆明醫科大學動物實驗中心提供[生產許可證號：SCXK（滇）2011-0004]，體重為2.4～3.6 kg。

1.1.2 試劑與設備? 左旋甲狀腺素鈉五水合物（美國MCE公司，1 g/瓶，生產批號：HY-18341A）;注射用異戊巴比妥鈉（上海上藥新亞藥業有限公司，規格：0.25 g，生產批號：20150814）;熒光定量PCR試劑盒（美國KAPA Biosystem公司）;cDNA逆轉錄試劑盒（瑞士Roche公司）;PCR引物（北京擎科生物技術有限公司）;BCA法蛋白濃度測定試劑盒（武漢博士德生物有限公司）;PVDF膜（美國millipore公司）;小鼠抗兔TH蛋白多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）;小鼠抗兔GAP-43蛋白多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）;羊抗小鼠IgG辣根過氧化物酶標記二抗（美國Santa Cruz公司）;兔去甲腎上腺素ELISA試劑盒（森貝伽生物公司）。多道電生理記錄儀（Labsystem PRO，巴德電生理醫療公司）;電生理刺激儀（EP-4-04，St. Jude Medical）;十極標測電極（1 mm/節，兩電極間距1 mm，相鄰電極對間距為2 mm，心諾普醫療技術有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 兔甲亢房顫易患模型的制備? 按照隨機數字表法將50只成年健康日本大耳兔分為給藥2月組（n = 20）、給藥4月組（n = 20）和對照組（n = 10）。給藥2月組每日腹腔內注射甲狀腺素50 μg/kg，持續注射2個月;給藥4月組每日腹腔內注射甲狀腺素50 μg/kg，持續注射4個月;對照組每日腹腔內注射等劑量生理鹽水，持續注射4個月。分別標記編號，記錄實驗前后的心率、體重。

1.2.2 左心房電生理指標檢測? 檢測于各組實驗結束后分別進行。用繩索將日本大耳兔外固定，耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉實施麻醉，劑量為30 mg/kg。在咽喉鏡輔助下經食道插入電極。刺激脈寬設定為1.0 ms，測定刺激閾值，以2～3倍閾值作為刺激強度。①左心房有效不應期（LAERP）[8]：為確保奪獲心房，測定刺激閾值時的刺激脈寬為2.0 ms，刺激頻率快于基礎心率10～20次。采用電生理刺激儀進行程序刺激，S1S1基礎刺激周長為200 ms、150 ms，以8∶1為S1S2的刺激比例，自不應期內遞增掃描，步長5 ms，將最長無法奪獲心房的S1S2間期作為LAERP，測量3次取平均值，單位：毫秒（ms）。②房顫誘發率：以電極遠端作猝發刺激，S1S1刺激周長100 ms，脈寬2.0 ms，刺激電壓是刺激閾值的2倍，30 s/次，刺激5次，查看誘發情況;基礎刺激周長200 ms，S1S2以5 ms步長，200/200 ms開始遞減刺激。若S1S1、S1S2刺激誘發出房顫持續10 min以上，則為誘發成功。

1.2.3 動物模型采血和左心房肌組織材料的收集? 各組兔左心房電生理檢測結束后經耳緣靜脈采血2 mL，經EDTA抗凝于4℃、3000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，分離血漿分裝于1.5 mL EP管中，于-70℃保存。以空氣栓塞方式處死兔，開胸取其心臟，于無菌臺切取左心房（包括房間隔），用磷酸鹽緩沖液沖洗去血，將左心房肌組織分為兩份，取一份置于15 mL無菌離心管，液氮保存;另一份以4%多聚甲醛固定。

1.3 相關分子生物學指標檢測

①ELISA檢測各組兔血漿去甲腎上腺素水平;②實時熒光定量PCR檢測各組兔左心房肌組織TH（前向引物5′-GTGGAGTACACGGCCGAGGAG-3′，逆向引物5′-GGATGTGGTCCTCGCTGTAG-3′）、GAP-43（前向引物5′-AAAATTCAGGCGAGCTTCCG-3′，逆向引物5′-TTCTTCTCCACCCCATCAGC-3′）mRNA表達水平，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GADPH）為內參（前向引物5′-CCACTTTGTGAAGCTCATTTCCT-3′，逆向引物5′-TCGTCCTCCTCTGGT GCTCT-3′）。實驗步驟：總RNA提取及鑒定，合成第一鏈cDNA，實時熒光定量PCR檢測;反應體系：RNase-free雙蒸水、qPCR Master Mix、模板、引物等;反應條件：95℃預變性5 min;95℃變性30 s;60℃退火30 s;72℃延伸1 min，30個循環后72℃延伸10 min。③采用免疫組織化學檢測各組兔左心房肌組織是否有神經重構發生，免疫印跡法檢測組織中TH和GAP-43蛋白水平，以目的蛋白條帶的光密度和內參β-actin的光密度的比值作為相對表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS l7.0軟件進行統計學數據分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用用LSD-t檢驗;計數資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組基礎資料比較

給藥2月組死亡2例，給藥4月組死亡3例。最終納入統計分析共45例。實驗前三組的體重、心率比較，差異無統計學意義（P > 0.05）;實驗后，給藥2月組和給藥4月組體重低于對照組，且給藥4月組體重低于給藥2月組（P < 0.05）;給藥2月組和給藥4月組心率快于對照組（P < 0.05）。見表1。

2.2 三組LAERP比較

刺激周長為200 ms和150 ms時，給藥2月組、給藥4月組LAERP均短于對照組，且給藥4月組均短于給藥2月組（P < 0.05）。見表2。

2.3 三組房顫誘發率比較

對照組未誘發房顫，給藥4月組房顫誘發率為41.2%（7/17），高于給藥2月組的16.7%（3/18），三組比較差異有統計學意義（P < 0.05）。給藥4月組房顫誘發率高于給藥2月組和對照組（P < 0.05）。

2.4 三組血漿去甲腎上腺素水平比較

三組去甲腎上腺素水平比較，差異有統計學意義（P < 0.05），給藥2月組和給藥4月組去甲腎上腺素水平高于對照組（P < 0.05）;給藥4月組和給藥2月組之間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖1。

2.5 三組左心房肌組織TH、GAP-43 mRNA表達水平比較

三組左心房肌組織TH mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（P < 0.05），給藥2月組、給藥4月組表達量高于對照組（P < 0.05）;給藥4月組和給藥2月組比較，差異無統計學意義（P > 0.05），見圖2。三組左心房肌組織GAP-43 mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（P < 0.05），給藥2月組、給藥4月組表達量高于對照組（P < 0.05），且給藥4月組表達量高于給藥2月組（P < 0.05），見圖3。

2.6 三組左心房肌組織TH、GAP-43蛋白表達量比較

免疫組織化學檢測發現給藥2月組、給藥4月組左心房肌均發生了交感神經重構，TH蛋白、GAP-43蛋白均有陽性表達。神經組織被染為棕褐色，如紅色箭頭所示，見圖4～5（封三）。進一步比較左心房肌組織TH、GAP-43蛋白表達，見圖6。三組左心房肌組織TH蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P < 0.05），給藥2月組、給藥4月組表達量高于對照組（P < 0.05），給藥4月組和給藥2月組之間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。三組左心房肌組織GAP-43蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P < 0.05），給藥2月組、給藥4月組表達量高于對照組，且給藥4月組表達量高于給藥2月組（P < 0.05）。見圖7。

3 討論

有關報道顯示，甲亢患者中有9%～22%的患者發生房顫，而房顫患者中約有13%的患者甲狀腺激素相關生化指標發生異常，兩者之間存在明顯相關性[9-10]。亞臨床甲亢和甲亢患者有同等的房顫發病率，亞臨床甲亢也是房顫的一大危險因素[11-12]。甲亢患者常伴有交感神經興奮，甲亢引起心臟損害部分依賴交感神經興奮。一方面，長期高甲狀腺素水平會可能引起心臟交感神經重構。Liu等[13]新近研究發現，甲亢大鼠心房交感神經發生重構。豬甲亢模型研究結果顯示，心臟交感神經被激活，心肌細胞膜上β腎上腺素受體數量高于正常對照組[14]。心房分布的β腎上腺素能受體較心室高，并且高甲狀腺素可上調心肌細胞β受體，心房可增加對兒茶酚胺的敏感性，致使自主神經結構和功能紊亂。另有研究發現，高位胸髓硬膜外麻醉可抑制心房電重構、解剖重構，減少房顫的發生和維持，提示交感神經參與了房顫的發生[15-16]。對兔自主神經刺激，可縮短心房和肺靜脈的有效不應期，改變心房的傳導性，促使房顫容易誘發及發作后持續時間延長[17]。另一方面，神經遞質去甲腎上腺素主要來自交感神經節后纖維，甲亢興奮交感神經，去甲腎上腺素經交感神經節后纖維釋放后，與腎上腺能受體結合，使心肌細胞多種離子通道特性改變，繼而縮短有效不應期和降低頻率適應性[18];甲狀腺激素還能刺激腎上腺髓質分泌兒茶酚胺，而且甲亢患者心血管對兒茶酚胺的敏感性增加。Jayachandran等[19]發現正常犬的心耳組織去甲腎上腺素的含量較房顫犬低。另有研究表明，心房神經節叢內的交感神經元興奮后，釋放更多的去甲腎上腺素，引起神經節叢附近的肺靜脈及心房肌細胞鈣負荷增加，誘發這些心房肌細胞的早期后除極，使觸發活動增加，從而形成肺靜脈及心房內的快速放電區，驅動房顫發生。反之，在檢測房顫患者的左心耳組織后發現，交感神經支配和局部去甲腎上腺素的表達量均明顯增加[20]，房顫患者交感神經被激活，進一步促進房顫發生[21]，因此房顫與交感神經互為因果促進。長期兒茶酚胺的作用最終引起心臟電重構、解剖重構，為一系列甲亢源性心臟疾病，尤其是房顫發生奠定基礎。

本研究發現，給藥2月組、給藥4月組較對照組體重下降，心率增快，LAERP縮短，房顫誘發率增高;給藥2月組、給藥4月組較對照組血漿去甲腎上腺素水平升高。研究結果提示在持續高甲狀腺素水平作用下，兔心臟交感神經被激活，部分動物模型具有甲亢源性房顫易患傾向。TH是交感神經遞質兒茶酚胺合成的限速酶，GAP-43是神經細胞發育、再生的一個相關因子;TH、GAP-43被認為是心臟自主神經的重要標志，二者表達水平可作為評價心臟自主神經分布、再生的依據。進一步研究發現，給藥2月組、給藥4月組較對照組左心房肌組織TH mRNA表達水平增高;給藥2月組、給藥4月組較對照組左心房肌組織GAP-43 mRNA表達水平增高，給藥4月組較給藥2月組mRNA表達水平進一步增高;免疫組織化學檢測發現給藥2月組、給予4月組左心房肌均發生了交感神經重構，TH蛋白、GAP-43蛋白均有陽性表達;給藥2月組、給藥4月組較對照組左心房肌組織TH蛋白相對表達量增高;給藥2月組、給藥4月組較對照組左心房肌組織GAP-43蛋白相對表達量增高，給藥4月組較給藥2月組蛋白相對表達量進一步增高。研究結果提示高甲狀腺素導致心房顫動發病過程中伴有心臟交感神經的激活、重構。

綜上所述，本研究已證實高甲狀腺素導致心房顫動過程中伴有心臟交感神經激活、重構，而甲亢導致房顫是一個未完全明確、復雜、多重機制的病理過程，其發病機制之一可能是心臟交感神被過度激活并發生重構，而進一步產生間接作用。因類似研究較少，尚缺乏全面、有力的依據，本研究結論仍需擴充樣本量，通過重復實驗進一步加以證實。

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（收稿日期：2018-06-22? 本文編輯：羅喬荔）