響應曲面優化超聲波輔助提取無花果葉總黃酮的工藝研究

蘇適，王雙俠

（綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江綏化152061）

無花果葉是桑科植物無花果（Ficus caricaL.）的葉片，我國擁有極為豐富的無花果種植資源，分布在我國中部、西北部、南部省份，有很高的營養價值。無花果葉中含有黃酮、糖類、果膠、單寧、維生素C 及微量元素等化學成分[1-2]。臨床研究表明，無花果葉提取物具有抗腫瘤、降血脂、抗氧化、抑菌和降血糖等作用[3-5]。無花果葉中含有大量的黃酮類化合物，黃酮具有很多藥理作用，能預防心血管疾病、抗骨質疏松、治療腹瀉、清除氧化自由基、降血脂、治療咽喉腫痛和調節免疫等作用[6-8]。

目前提取黃酮常用的傳統提取方法有醇提法、雙水相提取法、水蒸汽蒸餾法等[9-11]，成本低、便于操作，但費時、提取率偏低。近年來超聲提取法在中草藥的提取中應用較多，此法利用超聲波的空化效應和機械效應，破壞植物組織，加強總黃酮的溶出和擴散，將植物中的化學成分快速提取出來，從而提高產物的提取率[12]。與常規溶劑提取法相比，超聲輔助提取方法具有操作簡單方便、效率高，溶劑使用量少，耗時短，提取液雜質少等特點，已廣泛用于天然植物有效成分的提取。因此，本試驗利用超聲輔助法對無花果葉總黃酮的提取工藝進行優化，并結合響應面試驗設計優化法確定最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無花果葉：市售，制成粗粉。

蘆丁標準品（純度98%）：中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁（分析純）：國藥試劑有限公司。

1.2 試驗儀器

KQ-50B 超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；101C-2B 電熱鼓風干燥箱：上海市實驗儀器總廠；XV-9200 紫外分光光度計：北京市精密儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 無花果葉總黃銅的提取工藝流程

無花果葉粉末→粉碎（過40 目篩）→乙醇浸泡→超聲輔助提取→提取液→濃縮→干燥→無花果葉總黃酮提取物。

1.3.2 標準曲線

精確稱取蘆丁對照品10.0 mg，加乙醇溶解并定容，配制成濃度為0.10 mg/mL 的蘆丁標準溶液。采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[13]，用紫外分光光度法在波長510 nm 處測定梯度濃度溶液的吸光度，得到無花果葉總黃酮的線性回歸方程為：Y=0.012x-0.009，線性相關系數R2=0.997 3，由數據可分析得出標準品具有良好的線性關系。

1.3.3 提取率計算

取單因素試驗項下及響應面試驗項下的提取物，加乙醇溶解，并定容至50 mL 于容量瓶中，按1.3.2 項下方法測定其吸光度，并根據回歸方程，計算無花果葉總黃酮濃度，進而計算提取率。

式中：C為測得濃度；V為定容體積；F為稀釋倍數；M為原料質量。

1.3.4 單因素試驗

稱取無花果葉粗粉，采用超聲法：輔助提取總黃酮，各單因素變量分別設置為：超聲時間（20、30、40、50、60 min）；超聲功率（100、200、300、400、500 W）；乙醇體積分數（20%、30%、40%、50%、60%）；料液比[1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g/mL）]，分析各因素對提取率的影響。

1.3.5 響應面試驗設計

根據單因素試驗，選取液料比、超聲時間、乙醇體積分數、超聲功率4 個影響顯著的因素，根據Box-Behnken Design 中心組合設計原理，以總黃酮提取率為響應值，優化提取條件，因素水平見表1。

表1 響應面試驗設計Table 1 Design of response surface experiments

1.4 數據處理

采用Origin7.5 和Design-Expert 8.0 軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 超聲時間對提取的影響

超聲時間對無花果葉中總黃酮的提取率影響如圖1所示。

由圖1可知，總黃酮提取率隨著時間的延長逐漸上升，在40 min 時達到最大值。分析原因可能是隨著超聲時間的延長，超聲波產生的空化作用和機械震動的持續作用下，加速無花果葉中黃酮向溶劑中溶出。但隨著提取時間的繼續延長，總黃酮的提取率呈下降趨勢，在溶劑中超聲時間過長使組織中大量細胞破裂，部分黃酮發生反應導致化學結構被破壞，同時也會增加部分雜質的溶出[14]，最后造成總黃酮總提取率下降。因此，超聲時間選擇30 min～50 min 進行Box-Behnken 試驗設計。

2.1.2 超聲功率對提取率的影響

超聲功率對無花果葉中總黃酮的提取率影響如圖2所示。

圖1 超聲時間對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction yield of total flavonoids

圖2 超聲功率對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction yield of total flavonoids

由圖2可知。黃酮類物質的提取率隨著超聲強度的增大而提高，其原因是超聲強度越大，超聲波所產生的破碎效應和熱效應越明顯，能夠促使細胞壁破裂，無花果葉胞內的黃酮類物質的溶出加速。但超聲強度達到400 W 后，繼續增大超聲功率黃酮類物質的提取率反而逐漸減少，其原因可能是超聲強度過高，超聲波的機械作用增強，產生的熱量過多，造成某些黃酮物質的結構破壞[15]，致使總黃酮提取率下降。因此，超聲功率選擇200 W～400 W 進行Box-Behnken 試驗設計。

2.1.3 乙醇體積分數對提取率的影響

乙醇體積分數對無花果葉中總黃酮的提取率影響如圖3所示。

圖3 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

由圖3可知，提取率隨著乙醇濃度的增加而增加，但當乙醇體積分數達到50%后，再增加乙醇體積分數，提取率反而下降，可能是乙醇濃度不斷增大會使脂溶雜質、色素和糖類等物質大量溶出，而影響黃酮類化合物的溶出，使黃酮類化合物的提取率降低[16]。因此，乙醇濃度為30%～50%進行Box-Behnke 試驗設計。

2.1.4 料液比對提取率的影響

料液比對無花果葉中總黃酮的提取率影響如圖4所示。

圖4 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

由圖4可知，提取率隨著提取溶劑的量的增多而呈上升趨勢，但料液比大于1∶60（g/mL）時總黃酮的提取率出現下降。可能是無花果葉粉末在溶液中的分散程度也增大，接觸面積增大，有利于黃酮的提取；但當料液比超過1∶60（g/mL）時因為大量溶劑用會吸收一定的超聲波產，增加了超聲波破碎細胞的阻力，降低了細胞的破碎程度；也可能是因為溶劑體積過大時傳質過程受到影響，導致提取率下降[17]。因此，料液比選擇1∶50（g/mL）～1∶70（g/mL）進行Box-Behnken 試驗設計。

2.2 響應面結果分析

2.2.1 響應面設計及結果

響應面設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計方案Table 2 Response surface test design scheme

2.2.2 響應面的建立與分析

采用Design-Expert8.0.6 軟件對表2數據分析，得到二次回歸擬合方程Y=3.48+0.13A-2.5×10-4B+0.18C+1.750×10-3D+0.025AB-0.076AC+0.052AD-0.024BC-0.057BD+0.041CD-0.27A2+1.967×10-3B2-0.34C2-0.23D2

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

續表3 方差分析表Continue table 3 Variance analysis table

由表3可知，P＜0.000 1，說明回歸模型方程極顯著，即建立的模型有意義；失擬值P=0.320 5＞0.05，沒有顯著差異，說明回歸方程與試驗擬合良好，試驗誤差小；確定系數R2=0.981 3，調整系數R2Adj=0.962 6，說明模型方程與試驗擬合程度好，可用此模型對無花果葉總黃酮提取條件進行分析及預測。回歸方程各項方差分析表明，回歸模型一次項A、C為模型極顯著因素，二次項A2、C2和D2為模型極顯著因素，交互項AC為模型顯著因素，其余各項對無花果葉總黃酮得率影響均不明顯。各因素對提取率的影響作用：C＞A＞D＞B。

2.2.3 響應面分析

響應曲面圖可以顯著反映各因素之間相互作用的強弱，采用Box-Behnken 軟件進行分析，結果如圖5所示。

響應曲面越陡峭，則表明該因素對總黃酮得率的影響越大，響應值對于操作條件的改變越敏感，反之，曲面越平緩則影響越小；等高線能反映各因素間交互作用強弱，橢圓形說明兩因素交互作用顯著，而圓形則反之。由圖可知，超聲時間和乙醇體積分數曲線陡峭，說明二者相互作用對總黃酮提取率的影響極顯著；超聲時間與料液比的交互作用對總黃酮提取率的影響不顯著，表現為曲線較為平滑，且隨其數值的增加或減少，響應值無顯著性變化。等高線圖中，其線性呈橢圓或趨向橢圓，表明對總黃酮提取得率影響顯著，呈圓形則不顯著。

圖5 各因素交互作用對無花果葉總黃酮提取量影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots showing the interaction effects of four reaction conditions on total flavonoids yield of ficus carica leaves

2.2.4 驗證試驗

結合單因素試驗，分析回歸模型，經過驗證，最終得出該提取方法是準確可靠。無花果葉總黃酮的最佳提取條件：乙醇體積分數43.85%、超聲時間41.8 min、料液比1∶60.85（g/mL）、超聲功率200 W，理論預計值3.522%。結合試驗實際情況，最終選擇乙醇體積分數43%、超聲時間42 min、料液比1∶60（g/mL）、超聲功率200 W，進行3 次平行試驗，得到總黃酮提取率平均值為3.519%，與預測值接近，驗證了此模型的有效性，說明預測模型與實際情況擬合較好。

3 結論

根據響應面法優化無花果葉總黃酮提取條件，得出超聲波輔助法提取總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分數43%、超聲時間42 min、料液比1∶60（g/mL）、超聲功率200 W，進行3 次平行試驗，在此條件下無花果葉總黃酮的提取率可達3.519%。與傳統提取工藝相比，該提取工藝時間短，提高了總黃酮得率，為無花果葉的開發及利用提供了理論依據。