植物來源角鯊烯的制備與檢測方法研究進展

盧克剛，張紅霞

（1.山東職業學院，山東濟南250104；2.山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250101）

角鯊烯（squalene）是由6 個異戊二烯單位構成的鏈狀三萜化合物，含6 個全反式雙鍵，分子式為C30H50，化學名為2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。成品角鯊烯為微黃色至無色透明油狀液體，略帶特有的芳香氣味，易溶于乙醚、石油醚、丙酮和四氯化碳，微溶于醇和冰醋酸，不溶于水[1]。角鯊烯具有抗氧化[2]、抗輻射[3]、攜氧[4]、解毒[5]、調節膽固醇代謝[6]等良好的生物活性，應用于化妝品、保健食品、醫藥等領域。

角鯊烯分布廣泛，不僅存在于動、植物體內，在微生物體內亦有發現。深海鯊魚肝油中角鯊烯含量一般都在40 g/100 g 以上，被認為是早期角鯊烯的主要來源[7]。動物來源的角鯊烯需要大量捕殺以鯊魚為主的深海魚類，隨著生態保護意識的增強，使鯊魚肝油來源的角鯊烯越來越少。利用微生物代謝調控發酵生產角鯊烯，目前產量較低，存在生產用菌株、工程菌株獲得較難等諸多技術難題，還無法達到產業化水平。自1935年Thorbjarnarson T 等[8]首次在橄欖油中發現角鯊烯開始，人們逐漸重視植物來源的角鯊烯的研究與開發，研究發現莧菜籽油、羅漢果種仁油、米糠油、棕櫚油等農作物種子油及植物油脫臭餾出物（deodorizer distillate，DD）中均有角鯊烯，而含量較高的橄欖油和莧菜籽油更是成為制備角鯊烯的重要工業原料[9]，因此，開發植物資源的角鯊烯，將是解決角鯊烯來源的有效途徑。本文擬對近期植物來源角鯊烯制備方法和檢測方法的研究進展進行綜述，為角鯊烯的進一步開發應用提供參考。

1 植物來源角鯊烯的制備方法

角鯊烯的制備方法可分為兩類，一類是直接從生物材料中提取、純化，另一類是利用化學或生物技術手段合成。目前，植物來源的角鯊烯主要是直接從植物油、植物油脫臭餾出物及其他材料提取純化而得。由于油脂價格昂貴，直接利用植物油制備角鯊烯成本較高；植物油脫臭餾出物是植物油脂精煉過程中的副產物，角鯊烯也富集于其中，因此是制備角鯊烯的理想原料，其中橄欖油脫臭餾出物中的角鯊烯已實現規模化生產；其它如羅漢果種仁、茶籽仁、莧菜種子、省沽油種子、尾巨桉木材等也發現含有一定量的角鯊烯。

由于共存成分復雜、極性相近、含量較低、綜合利用等原因，一般植物來源角鯊烯的制備過程中要采用多種方法組合。常見的方法有溶劑提取、皂化、酯化、分子蒸餾、超臨界萃取、柱色譜等[10]，每種方法都有其特點。幾種植物來源角鯊烯制備方法[11-37]見表1。角鯊烯易溶于石油醚、三氯甲烷等溶劑，可利用索氏抽提與其他雜質分離；角鯊烯具有不可皂化性，像甘油三酯含量較高的原料可經皂化后，再用有機溶劑萃取而制得角鯊烯；游離脂肪酸、中性油含量較高的脫臭餾出物通常先用甲醇進行酯化處理，轉化為脂肪酸甲酯，再結合分子蒸餾法進行分離純化；以二氧化碳為溶劑的超臨界萃取對角鯊烯有較強的提純能力；柱色譜法有較好的選擇性，一般用硅膠作為固定相，非極性的角鯊烯不易被吸附首先流出，其他極性較大的物質易被吸附而有效分離，要得到高純度角鯊烯大多都采用了柱色譜工藝；其它利用銀離子絡合[35]、環糊精包合[36]等法也可以對角鯊烯進行有效分離。

表1 幾種植物來源角鯊烯的制備方法Table 1 Preparation methods of squalene from several plants

2 植物來源角鯊烯的檢測方法

美國官定分析化學家協會（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）標準（Revised 1996）中采用滴定法測定角鯊烯的含量[38]，該方法檢測過程比較繁瑣、費時費力，而且誤差較大。目前，文獻報道的植物來源角鯊烯的檢測方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）、液相色譜法（liquid chromatography，LC）和氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）。液相色譜法包括高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography，UPLC）。在定量方式方面，氣相色譜法和液相色譜法大多采用外標法，而內標法應用較少；氣相色譜-質譜聯用法則主要采用內標法定量。

在檢測角鯊烯過程中，根據不同樣品的特點選用適宜的預處理方法，常見的有溶劑稀釋、皂化后萃取、凝膠色譜凈化、固相萃取、索氏提取器抽提、甲酯化后萃取等方法。雜質干擾較少的樣品可采用溶劑稀釋后直接進樣。對于富含脂類和色素等干擾較多的樣品，則進行適當的預處理方可進行儀器分析，否則干擾物會影響色譜柱的分離效果，嚴重時可造成整個色譜系統的污染。糧食行業標準LST 6120-2017《糧油檢驗植物油中角鯊烯的測定氣相色譜法》就是利用角鯊烯的不皂化性，植物油樣品先經氫氧化鉀-乙醇溶液皂化，再經正己烷萃取，以角鯊烷為內標測定角鯊烯的含量[39]。

2.1 氣相色譜法

影響氣相色譜法檢測的主要因素有毛細管柱、柱溫、載氣流速和檢測器等。由于角鯊烯具有高沸點（285 ℃）、難揮發等特點，為保證其充分氣化，所以選取非極性的高溫低流失毛細管柱，文獻中多選HP-5毛細管色譜柱（30.0 m×0.32 mm×0.25 μm）。柱溫的控制主要有恒溫、程序升溫兩種方式，由于植物來源的樣品基質較為復雜，通常采用程序升溫方式，以實現角鯊烯與樣品中其他組分有效分離。氣相色譜法常用的氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）對碳氫化合物有較高靈敏度，角鯊烯是由碳和氫兩種元素組成，文獻報道中都選用FID 檢測器。幾種植物來源角鯊烯的氣相色譜法檢測方法[40-46]見表2。

表2 幾種植物來源角鯊烯氣相色譜檢測方法Table 2 Determination of squalene in plants by GC

續表2 幾種植物來源角鯊烯氣相色譜檢測方法Continue table 2 Determination of squalene in plants by GC

2.2 液相色譜法

色譜柱、流動相體系、洗脫模式和檢測器的選擇是影響液相色譜法的主要因素。由于角鯊烯是非極性化合物，故以表面鍵合極性相對較弱的十八碳烷烴的反相C18柱比較適合角鯊烯的測定，而一般不選擇正相色譜柱。根據樣品中各化合物的極性大小差異，植物來源角鯊烯檢測時使用的流動相體系主要有一元、二元體系，并且以二元體系為主。一元溶劑體系主要是甲醇，二元溶劑體系主要有甲醇/乙腈、乙腈/叔丁基甲醚、乙腈/四氫呋喃等組合。預處理后樣品組分相對簡單，在洗脫模式方面多采用等度洗脫，而少數比較復雜的樣品則采用梯度洗脫。由于角鯊烯在紫外光區有吸收峰，目前檢測器絕大多數選擇的是紫外檢測器和二極管陣列檢測器，波長范圍大多在203 nm～210 nm之間。幾種植物來源角鯊烯的高效液相色譜法檢測方法[47-56]見表3。

表3 幾種植物來源角鯊烯高效液相色譜檢測方法Table 3 Determination of squalene in plants by HPLC

續表3 幾種植物來源角鯊烯高效液相色譜檢測方法Continue table 3 Determination of squalene in plants by HPLC

由于超高效液相色譜（UPLC）使用的填料粒徑更小、死體積更小、工作壓力更高、線性速度更快，所以在靈敏度和分析速度等方面比HPLC 都有很大提高。陳偉珠等[57]使用超高壓液相色譜儀配TUV 檢測器，以甲醇-水（95∶5，體積比）、流速0.4 mL/min、波長210 nm的條件下進行檢測，角鯊烯在0.2 μg/mL～10 μg/mL 范圍內濃度和面積呈現良好的線性關系，檢測限為0.1 ng，平均回收率為100.82%，樣品的保留時間縮短，節約溶劑，提高了檢測效率。

2.3 氣相色譜-質譜聯用法

與氣相色譜法、液相色譜法相比，氣相色譜-質譜聯用法具有較高的靈敏度和選擇性。該法中氣相色譜條件的選擇與氣相色譜法一致，多采用弱極性HP-5MS 毛細管柱和程序升溫方式。氣相色譜-質譜聯用法最常用的離子化方式是電子轟擊離子化（EI）和化學離子化（CI）。EI 源適合絕大多數化合物的檢測；而CI源對高親電化合物的靈敏度高、選擇性強，對某些帶有強電負性（如含有Cl、F、O、Br 等）的化合物檢測時具有獨特的優越性。角鯊烯不具有電負性，所以測定角鯊烯最常用的是EI 源。質譜質量分析器有四極桿和離子阱，其掃描模式主要采用選擇離子掃描（SIM）和全掃描（Scan）兩種，其中SIM 掃描選定離子結構信息，常用于微量或痕量組分的定量分析，而Scan 掃描所有未知物結構信息，測量較為全面，主要用于組分的定性分析。幾種植物來源角鯊烯氣相色譜-質譜聯用法檢測方法[58-65]見表4。

表4 幾種植物來源角鯊烯氣相色譜-質譜檢測方法Table 4 Determination of squalene in plants by GC-MS

續表4 幾種植物來源角鯊烯氣相色譜-質譜檢測方法Continue table 4 Determination of squalene in plants by GC-MS

3 結語

角鯊烯具有多種生物活性，應用于多個不同領域。因其能夠抗氧化、抗紫外線、保濕、營養肌膚而在化妝品中用作潤膚劑、保濕劑[9]，還可作為功能性食品添加劑、藥物緩釋劑、食品機械設備的潤滑劑、衣物護理劑等使用[1]。隨著人們對角鯊烯認識的不斷深入，對其需求會不斷加大。以上綜述可見角鯊烯的植物來源比較廣泛，相比較動物來源和微生物發酵更具有可持續性，會成為解決角鯊烯來源的一條重要途徑。但由于角鯊烯在大多數植物體中含量較低，導致單一提取制備成本較高，應探索綜合開發利用。因此，在角鯊烯的研究開發過程中，要不斷優化制備工藝，多采用先進提取分離技術，降低能耗，減少有毒有害溶劑的使用，開發出更加高效、環保、可行的方法。目前的檢測方法對前處理要求高、過程復雜，所用大型儀器價格昂貴，不能大量普及。因而應研究開發更高效、穩定、便捷的基質前處理方法，實現復雜基質有效凈化，提高檢測效率。