不同采收期三白草中總黃酮含量測定及抗氧化活性研究

金佳慧，范嘉琪，李嬌嬌，金利春，陳宏降*

（浙江醫藥高等專科學校·浙江寧波·315100）

中藥三白草為三白草科植物三白草Saururus chinensis(Lour.)Baill的干燥地上部分，具有利尿消腫，清熱解毒的功效，臨床上主要用于肝炎和泌尿系統感染等。三白草中含有金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、萹蓄苷等多種黃酮類成分，其中金絲桃苷，萹蓄苷等多種黃酮具有利尿和抗炎等藥效[1]。2015年版《中國藥典》中三白草藥材沒有明確規定采收期（全年均可采收）[2]，三白草總黃酮可改善Ⅱ型糖尿病胰島素抵抗大鼠的糖、脂代謝紊亂及胰島素抵抗，其作用機制與降低血清FFA及改善氧化應激狀態有關[3]，三白草總黃酮還能明顯改善高脂血癥模型大鼠的血脂水平，改善血流變學指標，三白草治療6周后各組大鼠血脂指標[膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）]、血流變學指標及血管內皮細胞因子的表達水平均出現不同程度改善[4]。

研究表明三白草葉中槲皮素，槲皮苷，金絲桃苷和蘆丁等含量是莖中的15-70倍[5]，三白草為多年生草本，生長過程中地上部分會枯萎，葉片脫落，這勢必會造成不同采收期三白草中的化學成分含量存在較大差異。項目組前期研究表明不同采收期三白草中槲皮素、蘆丁、槲皮苷等黃酮類成分存在較大差異[6]，因此，本文進一步對不同采收期三白草的總黃酮含量和清除DPPH自由基活性進行研究，為三白草最佳采收期的確定提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：不同采收期三白草藥材于每月10日采自中國藥科大學藥用植物園，經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定為Saururus chinensis(Lour.)Baill的干燥地上部分。

供試試劑：蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號 0080-9705）；DPPH（1,1-二苯基苦基苯肼，美國Sigma公司）；亞硝酸鈉（南京化學試劑股份有限公司）；硝酸鋁（南京化學試劑股份有限公司）；氫氧化鈉（上海國藥集團化學試劑有限公司）；鄰菲羅林（國藥集團化學試劑有限公司）。

供試儀器：島津UV-2401PC紫外分光光度計（日本島津公司）；酶聯免疫儀（南京華東電子集團醫療設備責任有限公司）；AY220型電子天平 （日本島津公司）；AS20500A型超聲清洗儀 （天津超聲科學儀器廠）；萬能粉碎機（河北黃驊市粉碎儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備

對照品溶液的制備：精密稱取干燥至恒重的無水蘆丁25.00 mg，置50 mL量瓶中，加入95%乙醇適量超聲處理使溶解，放冷，加95%乙醇至刻度搖勻，即得0.5 mg/mL對照品溶液。

供試品溶液的制備：取三白草粗粉0.5 g，加入20 mL 50%乙醇，精密稱定重量，回流1 h，冷卻后以50%乙醇補足重量，過濾，取續濾液即得。

1.2.2 波長選擇

分別吸取蘆丁對照品溶液和供試品溶液0.5 mL，置10 mL具塞刻度試管中，加5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，混勻放置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，混勻放置6 min，加氫氧化鈉試液4.0 mL，再加水至刻度，搖勻，放置 15 min，于 400～800 nm掃描，結果對照品溶液和供試品溶液在510 nm有相似的吸收峰，同時參照文獻[7,8]，選擇510 nm作為測定波長。

1.2.3 標準曲線的制備

精密量取對照品儲備液 0.0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 mL分別置10 mL具塞刻度試管中，加5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，混勻放置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，混勻放置6 min，加氫氧化鈉試液4.0 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，在 510 nm波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，蘆丁含量為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.4 方法學考察

精密度試驗：取供試品溶液0.5 mL共6份，分別置10 mL具塞刻度試管中，按照1.2.2項顯色，在510 nm處測定吸光度，計算RSD。穩定性試驗：取同一份供試品溶液，按照1.2.2項顯色后60 min內，在室溫下每隔10 min測定一次吸收度，計算RSD。重復性試驗：取三白草粗粉約0.5 g，按1.2.1項“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，平行制備6份，分別按照1.2.2項顯色，在510 nm處測定吸光度，計算RSD。加樣回收率試驗：取已知含量的三白草粗粉約0.25 g，平行6份，精密稱定，分別精密加入一定量的蘆丁對照品溶液，按照1.2.2項操作，進行含量測定并計算回收率和RSD。

1.2.5 三白草總黃酮含量測定

精密量取0.5 mL供試品溶液置于10 mL具塞刻度試管中，加5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，混勻放置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，混勻放置 6 min，加氫氧化鈉試液4.0 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，在510 nm波長處測定吸收度，根據回歸方程以蘆丁為對照品計算樣品中總黃酮含量。

1.2.6 清除DPPH自由基（DPPH·）能力的測定

參照文獻[9,10]并稍作修改：精密移取不同濃度的供試品溶液 100 μl，置 96 孔板中，再加入 200 μg/mL 的DPPH·標準液 100 μl，振蕩后，反應 30 min，每樣品平行測定3孔，于517 nm處測定吸光度值Ai；以乙醇代替供試品在517 nm處測定吸光度值Ac；供試品溶液（100 μl供試品+100 μl空白溶劑）在 517 nm 處測定吸光度值Aj，分析比較不同供試品DPPH·清除率。并采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計算不同采收期三白草樣品清除DPPH·的IC50。樣品液對DPPH·清除率計算如下：

清除率（%）=[1－(Ai－Aj)／Ac]×100%

1.2.7 還原Fe3+能力的測定

參照文獻[11]并稍作修改：以去離子水分別配制2 mM的FeCl3和鄰菲羅林溶液，于實驗前將兩者按1：1體積比混合，混合液加入96孔細胞培養板，80 μl/孔，然后加入各樣品溶液20 μl/孔，使樣品終濃度為100 μg/mL，每樣品平行測定3復孔，空白對照組以空白溶劑代替待測樣品，混勻振蕩后于室溫下靜置30分鐘，于517 nm處測定吸光度（OD值）。

2 結果與分析

2.1 線性關系的考察

考察結果得出回歸方程為Y=1.1408X-0.0042，R=0.999，表明蘆丁在0.01～0.1 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.2 方法學考察

精密度試驗RSD為0.99%，表明儀器的精密度良好。穩定性試驗RSD為1.65%，表明供試品溶液在60 min內穩定性良好。重復性試驗RSD為1.96%，表明本法重復性良好。加樣回收率試驗，平均回收率為99.62%，RSD為2.37%，表明本法回收率良好，方法可行，具體結果見表1。

表1 三白草總黃酮加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.1 The recovery rate test results of total flavonoids in Saururus chinensis(n=6)

2.3 不同采收期三白草總黃酮含量

不同采收期樣品中總黃酮含量存在較大差異，總黃酮以蘆丁計算，不同采收期三白草中總黃酮含量在3.40～67.56 mg/g，其中在 5月份（幼苗期）和 8月份（果實期）總黃酮含量存在兩個明顯的峰值，含量分別為67.56和44.61 mg/g，具體結果見表2。

表2 不同采收期三白草中總黃酮及抗氧化活性測定結果 （n=3）Tab.2 Total flavonoids contents and antioxidant activity of Saururus chinensis from different harvesting stages(n=6)

2.4 不同采收期三白草清除DPPH·能力

結果表明不同采收期三白草均具有較強的清除DPPH·活性，IC50 在 2.35～28.98 mg/mL， 與不同采收期三白草中總黃酮含量測定結果相似，5月和8月份采收的三白草清除DPPH·活性亦較其他采收期強，IC50分別為2.35和2.57 mg/mL，表明總黃酮可能為三白草抗氧化的主要藥效物質基礎，具體結果見表2。

2.5 不同采收期三白草還原Fe3+能力

還原能力是體外抗氧化活性的一個重要指標，還原能力越強，Fe3+被還原為Fe2+，Fe2+與鄰菲羅林生成穩定的紅色絡合物，在510 nm處有最大吸收，吸光度越大即表明還原Fe3+能力越強。結果表明不同采收期三白草還原Fe3+能力存在較大差異，5月和8月份采收的三白草具有較強的還原較大的Fe3+能力，OD值分別為0.827和0.745，具體結果見表2。

3 結論與討論

三白草所含的槲皮素和槲皮苷等黃酮類成分為醛糖還原酶抑制劑，能抑制葡萄糖和半乳糖還原成相應的多元醇，對于阻止由糖尿病引起的白內障，神經病和血管類疾病的發生具有重要作用，本文建立的三白草中總黃酮含量測定方法簡便，快捷，可用于三白草的質量控制。

2015年版《中國藥典》中三白草藥材沒有明確規定采收期，試驗結果表明不同采收期三白草總黃酮含量存在較大差異，其中以5，8月中含量較高，與前期測定的槲皮苷等5個黃酮單體化合物在不同采收期種含量變化規律相一致[6]。體外抗氧化活性研究亦表明5月和8月份采收的三白草具有較強的清除DPPH自由基活性和還原Fe3+能力，表明黃酮類化合物為其抗氧化的主要藥效物質基礎。綜上所述，三白草在5月份剛出土，為幼苗期，產量較低；8月為果實期，地上植株較大，產量較高，根據有效成分總量最高原則，三白草的適宜采收期以8月（果實期）為佳，這與傳統的全草類藥材宜咋在植株充分生長，莖葉茂盛時采收相一致。