鹿茸補骨片對去卵巢骨質疏松癥大鼠骨密度及子宮濕重的影響

盧美彤，房辰晨，孫敬蒙*

（1長春中醫藥大學藥學院，長春130117；2吉林大學白求恩第一醫院藥學部，長春130021）

骨質疏松是以成骨不足、骨量減少為特征的全身代謝性骨病[1]。骨密度作為骨質疏松癥的預測指標[2～4]，其保健食品的開發引起了醫藥工作者的高度關注。鹿茸是我國珍稀名貴的動物藥材,有“益精髓,強筋骨”之功效,并富含大量有助維持骨密度的膠原蛋白[5～6]，在食品 、醫藥 、保健品、化妝品等多行業中得到廣泛應用[7]。鹿茸補骨片是以馬鹿茸為主，熟地黃、黃芪和骨碎補為輔的中藥保健食品。其主要作用是為了預防骨質疏松癥的發生。本實驗是以SPF級雌性SD大鼠為研究對象，研究鹿茸補骨片是否能增加去卵巢大鼠骨密度的及子宮濕重的功能性研究。

1 材料

1.1 動物

SPF級雌性SD大鼠購自遼寧長生生物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(遼)2010-0001，在SPF級動物實驗中心 （屏障環境）飼養 （許可證號：SYXK(黑)2011007），溫度為 21～23℃，濕度為 55%～58%。試驗動物所用的清潔級飼料購自北京科澳協力飼料有限公司（許可證號：SCXK(京)2009-0012）。

1.2 樣品

鹿茸補骨片，由哈爾濱久盛醫藥科技開發有限公司提供（批號：20160501），以馬鹿茸、黃芪、骨碎補、熟地黃為原料，樣品為異形片劑，0.53g/片（每片含生藥馬鹿茸0.24g，黃芪 0.78g，熟地黃0.78g，骨碎補0.52g），推薦成人（60kg計）用量為每次2片，每日 2次。

1.3 儀器

Water purifier超純水機（四川沃特爾科技發展有限公司）、JJ2000型電子天平 （常熟市雙杰測試儀器廠）、AR2140型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、雙能X線骨密度儀、原子吸收分光光度計、電子天平、精密卡尺、動物解剖器械、灌胃針、注射器等。

2 實驗方法

2.1 大鼠卵巢切除術

大鼠經腹腔注射30 mg/kg BW的戊巴比妥鈉溶液麻醉，腹胃固定后于腹中線距陰道口3～4cm處去毛，分別用碘酒和酒精消毒待稍干后切開皮膚和腹肌約2～3cm，切口視野可見白色脂肪，撥開脂肪層找到子宮后，輕輕將一側子宮角拉出，在其末端可見被脂肪團包裹的卵巢。分離脂肪團，便可見到粉紅色或黃紅色的卵巢，以止血鉗夾住卵巢，然后將卵巢下輸卵管用絲線結扎，剪除卵巢，順勢將子宮角送回腹腔中。同法剪除另側卵巢。腹肌和皮膚分層縫合后，再次消毒。最后經后肢肌肉注射2萬U青霉素。也可經背部肋脊角切口行卵巢切除術。為保證手術成功，大鼠摘除卵巢后5天，進行陰道涂片檢查，每天一次，連續7天，以檢查大鼠卵巢是否完全摘除。如涂片呈動情反應（鏡下見大量半透明、扁平的表皮細胞），表明動物卵巢切除不完全，應棄去不用[8]。

2.2 對大鼠子宮濕重影響試驗

2.2.1 動物分組

清潔級Wistar大鼠，雌性，200g±20g。實驗設空白對照組、模型組、雌激素組，馬鹿茸-熟地黃-黃芪-骨碎補組，設高、低兩個劑量組，每組10只動物。

2.2.2 劑量選擇與受試動物給予方式

高劑量混懸液相當于大鼠灌胃馬鹿茸1.0g/kg·bw、熟地黃 3.25g/kg·bw、黃芪 3.25g/kg·bw、骨碎補2.16g/kg·bw，實驗前用蒸餾水按馬鹿茸-熟地黃-黃芪-骨碎補（1：3.25：3.25：2.16）配置成相應濃度混懸液（0.8g/g），一次配置2周用量，冷藏備用；低劑量混懸液相當于大鼠灌胃馬鹿茸0.1g/kg·bw、熟地黃0.325g/kg·bw、黃芪 0.325g/kg·bw、骨碎補 0.216g/kg·bw，實驗前用蒸餾水按馬鹿茸-熟地黃-黃芪-骨碎補（1：3.25：3.25：2.16）配置成相應濃度混懸液（0.8g/g），一次配置2周用量，冷藏備用。大鼠藥物干預組于術后3天起開始經口灌胃給藥，連續給藥3個月，給藥體積10ml/kg。空白對照組大鼠給予等體積蒸餾水，雌激素組大鼠灌服尼爾雌醇，每次劑量為1mg/kg體重，溶于2 ml蒸餾水，每周2次。每周稱重一次，按體重及時調整給藥劑量。

2.2.3 樣品制備

取處方量黃芪、骨碎補，加入8倍量70%乙醇，提取二次，每次1.5小時；濾過，合并濾液，回收乙醇；藥渣與熟地黃加入8倍于藥材量水煎煮三次，每次1.5小時，濾過，合并濾液，與醇提液合并，濃縮至所需體積，放冷，加入馬鹿茸細粉，混勻，用蒸餾水定容配置成實驗分組中高、低濃度的混懸液，即得。

2.2.4 觀察指標

大鼠藥物干預組于術后3天起開始經口灌胃給藥，連續給藥3個月，每周稱重一次，按體重及時調整給藥劑量。主要觀察大鼠體重并稱取子宮濕重。

2.3 增加骨密度實驗

2.3.1 動物分組

SPF級雌性SD大鼠50只，雌性，200g±20g。適應性飼養7天后隨機分成5組，每組10只。

2.3.2 劑量選擇與受試動物給予方式

以廠家日推薦成人（體重以60 kg計），每天攝入定型產品為2次/日，2片/次，即2.12g/日，以廠家日推薦成人攝入量的5、10、30倍設置灌胃劑量，即0.15g、0.30g、0.90g/kg·bw，作為低、中、高劑量組，設蒸餾水為空白對照組，各組小鼠灌胃量均為10ml/kg·bw進行灌胃，溶劑均為蒸餾水，連續灌胃90天。

2.3.3 觀察指標

a.骨密度測定

將待測股骨放置測量臺上，與骨密度儀探測頭移動方向垂直，移動待測股骨，令其待測點標記線與探測頭移動軌跡與測量臺上的垂直投影重合。開始測量，每個點測量兩次，兩次測量誤差不大于10%。將兩次結果取平均值[9～10]。

b.骨鈣含量測定

取大鼠一側股骨，在105℃烘箱中烘干至恒重后，精密稱重和精密測量長度，記錄數值。將股骨研成粉末，精密稱取適量（0.300～1.000 g），置于 150 mL 三角瓶中，上蓋小漏斗，加入混酸（硝酸：高氯酸=4：1）15-20 mL，在電熱板上加熱消化直至冒白煙并透明無色。消化液透明無色后加入少量去離子水，煮沸，除去剩余的酸，重復兩次，最后消化液體積不超過1 mL。空白對照為相同體積的混酸，按照樣品處理相同方法消化制得。原子吸收法測定骨鈣含量[11]。

2.4 統計學方法

采用SPSS軟件進行數據分析。進行方差齊性檢驗，若方差齊，則計算F值，F＜F0.05。

3 試驗結果

3.1 對子宮濕重的影響

結果表明，造模后中藥復方給藥組體重較空白對照組明顯增加，馬鹿茸+熟地黃+黃芪+骨碎補高低劑量組與空白對照組及模型組相比均有極顯著差異（P＜0.01）。造模后各實驗組子宮濕重較空白對照組比較明顯減輕，其中，經雌激素給藥干預后子宮濕重最大，與空白對照組相比，馬鹿茸+熟地黃+黃芪+骨碎補組子宮濕重有極顯著差異（P＜0.01）。骨密度下降可能與體內雌激素減少引起脂代謝異常，子宮缺乏刺激，骨轉化加快，骨重建呈負平衡等有關，經馬鹿茸+熟地黃+黃芪+骨碎補給藥后，子宮濕重明顯增高，證明該劑量受試物對卵巢摘除大鼠骨密度降低有明顯改善作用。結果見表1。

表1 鹿茸補骨片對卵巢摘除大鼠體重及子宮濕重的影響結果 （±s，n=10 ）

表1 鹿茸補骨片對卵巢摘除大鼠體重及子宮濕重的影響結果 （±s，n=10 ）

與空白對照組相比 **P＜0.01，*P＜0.05；與模型組相比△△P＜0.01，△P＜0.05。

分組 體重（g）子宮濕重（mg）空白對照組 262.29±5.69 441.4±11.72模型組 263.96±7.12 130.3±10.72**雌激素組 271.62±7.49** 205.0±11.26**△△馬鹿茸+熟地黃+黃芪+骨碎補高劑量組 288.99±7.64**△△ 190.0±10.25**△△低劑量組 282.63±9.38**△△ 185.3±9.83**△△

3.2 受試樣品對大鼠體重的影響

統計學處理，給予受試物90天后，低、中、高劑量組的初始體重、給樣前體重、30天體重、60天體重及90天體重與空白對照組或模型對照組之間比較均無顯著性差異（P＞0.05）。結果見表2。

表2 受試物對大鼠體重的影響

3.3 受試樣品對大鼠股骨長度和骨密度的影響

經統計學處理，給予受試物90天后，受試物中、高劑量組股骨中心骨密度和股骨遠心端骨密度均顯著高于模型對照組（P＜0.05）。結果見表3。

表3 受試樣品對大鼠股骨長度和骨密度的影響

3.4 受試樣品對大鼠股骨重量和骨鈣含量的影響

經統計學處理，給予受試物90天后，受試物低、中、高劑量組骨鈣含量均顯著高于模型對照組（P＜0.05）。

表4 受試樣品對大鼠股骨重量和骨鈣含量的影響

4 結論

鹿茸補骨片由四味中藥配伍，相得益彰，共奏補血填精，固腎健骨之效[12～13]。藥效學實驗表明，鹿茸補骨片對去卵巢大鼠的體重及子宮濕重有明顯的增加，所以可以表明鹿茸補骨片具有能夠增加骨密度的藥效學。在功效學實驗中，鹿茸補骨片能夠增加去卵巢大鼠的股骨長度、骨密度、股骨重量及骨鈣含量，以上結果表明，鹿茸補骨片具有良好的增加骨密度的功能，可供骨鈣流失速度快的人群使用，從而達到預防骨質疏松癥的作用。