三七丹參片急性毒性實驗研究

董勇波 ，高明海 ，游曉蕾 ，張興城，張維清 ，趙 愛*

（1.文山華信三七股份有限公司，文山663099；2.云南省文山學院文山三七研究院，文山663099）

三七為五加科植物，藥理作用廣泛，具有抗疲勞、耐缺氧、活血化瘀及提高免疫功能等多方面的用。丹參,為唇形科植物丹參的干燥根和根莖，具有活血祛瘀，通經止痛，清心除煩，涼血消癰之功效。本研究通過小鼠急性毒性實驗研究，探討三七丹參片的毒副作用，為進一步開發新產品提供幫助。

1 實驗部分

1.1 樣品性狀及處理

受試物由文山華信三七股份有限公司出品（北京御生堂保健食品有限公司生產），批號：20170801。送檢樣品為片劑，常溫、干燥、通風保存。進行實驗前，將樣品經粉碎機粉碎后供實驗用。

1.2 實驗動物和試劑

1.2.1 實驗動物

選浙江省實驗動物中心提供的SPF級健康、斷乳、體重60～80g的SD大鼠80只，雌雄各半。實驗動物生產許可證號為SCXK(浙）2014-0001、實驗動物使用許可證號為SYXK(浙)2014-0008。實驗動物飼料由浙江省實驗動物中心提供。檢測環境條件，室溫20～25℃,相對濕度范圍 40%～70%。

1.2.2 實驗試劑

2-乙酰氨基芴：Sigma-A1drich公司，批號STBF2332V；1,8-二羥基蒽醌：Sigma-A1drich 公司，批號WXBC4791V；疊氮鈉：北京鼎國生物技術有限責任公司，批號：81G10150；敵克松 Chemservice公司，批號：285-75B；絲裂霉素 C：Roche公司，批號M0308A；環磷酰Sigma-A1drich公司,批號：WXBC5093V。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠急性經口毒性實驗：

1.3.1.1 實驗動物

選用健康、成熟，體重18～22glCR小鼠20只，雌雄各半。

1.3.1.2 劑量和給藥方法

按最大耐受量法設20.0g/kg體重一個劑量組。稱取樣品20g,以1%羥甲基纖維素鈉為溶媒配制成40ml樣品液。小鼠灌胃前禁食 （不禁水）16小時，按20ml/kg體重灌胃容量灌胃二次，間隔4小時。末次灌胃2小時后動物自由進食、飲水，記錄動物中毒表現及死亡情況。

1.3.1.3 觀察指標

灌胃后，觀察小鼠的一般狀況、中毒表現和死亡情況。觀察期限為7天，記錄小鼠初期及期末體重。2.3.1.4觀察結果：小鼠急性經口毒性實驗：小鼠死亡情況見表1。實驗期間，各小鼠均未見明顯中毒表現，也無死亡。山里有三牌三七丹參片對雌雄小鼠經口MTD均大于20.0 g/kgBW，屬無毒級。

表1 山里有三牌三七丹參片小鼠急性毒性死亡情況

1.3.2 Ames實驗

1.3.2.1 實驗菌株

選用組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌，共四株，即 TA97a、TA98、TA100、TA102。 菌株由上海市疾病預防控制中心提供，經生物學鑒定合格后進行實驗。

1.3.2.2 劑量選擇及陽性對照物：實驗采用平板摻入法。稱取樣品0.50g，以DMSO研磨制成10.0ml樣品液，0.103Mpa、實驗時以滅菌DMSO梯度稀釋至各劑量。用TA100菌株的非代謝活化系統進行預實驗，結果在劑量為5000μg/皿時未出現明顯的增菌和抑菌現象，故正式實驗時選擇實驗濃度為8、40、200、1000、5000μg/皿五個劑量組，外加空白對照、溶劑對照和陽性對照組（疊氮鈉、敵克松、2-乙酰氨基芴、1,8-二羥基蒽醌）。每種菌株每個測試濃度設三皿平行，在加和不加S9條件下進行實驗。

1.3.2.3 觀察指標

直接計數培養基上各菌株的回變菌落數。

1.3.2.4 結果判定

以計數培養基上回變菌落數的多少而定，如在背景生長良好條件下，受試物組回變菌落數增加一倍以上，并有劑量反應關系或至少某一測試點有可重復的并有統計學意義的陽性反應，即可認為該受試物Ames實驗為陽性。

1.3.2.5 Ames實驗結果

各菌株回變菌落數見表2。從實驗結果可見，不同濃度受試物在加和不加S9條件下的回變菌落與陰性對照組相近似，而陽性對照組回變菌落數均高于陰性對照組回變菌落數2倍以上。山里有三牌三七丹參片Ames實驗檢測結果為陰性

表2 山里有三牌三七丹參片Ames實驗結果

1.3.3 小鼠骨髓細胞微核實驗

1.3.3.1 實驗動物

選用健康、成熟，體重25～30g的小鼠50只，雌雄各半。小鼠隨機分成5組，每組10只，雌雄各半。

1.3.3.2 劑量和給藥方法

實驗設2.5、5.0、10.0g/kg BW三個劑量組，分別稱取樣品5.0、10.0、20.0g，以1%羥甲基纖維素鈉為溶媒分別配制成40ml樣品液。另設一個陰性對照組（1%羥甲基纖維素鈉）和一個陽性對照組（環磷酰胺40mg/kgBW,稱取環磷酰胺80mg，加蒸餾水溶解至40ml備用）。小鼠按20ml/kgBW灌胃容量經口灌胃給予受試物，灌胃兩次，間隔24小時。于第二次灌胃后6小時頸椎脫臼處死動物，取胸骨骨髓制成骨髓片，甲醇固定，Giemsa染色。

1.3.3.3 觀察指標

鏡檢時每只動物計數1000個嗜多染紅細胞，計算微核千分率及PCE/NCE值。數據用SPSS統計軟件進行統計分析。

1.3.3.4 小鼠骨髓細胞微核實驗結果

雌雄各劑量組PCE/NCE比值均未低于陰性對照組 的20%,符合技術規范要求。山里有三牌三七丹參片對小鼠微核率的影響見表3。與陰性對照組比較，雌雄各劑量組微核千分率均無顯著性差異 （P＞0.05);陽性 對照組微核率則顯著高于陰性對照組，其差異有顯著性意義（P＜0.01)。本實驗條件下，未見山里有三牌三七丹參片對小鼠骨髓細胞微核率產生明顯影響，本次檢測結果為陰性。

表3 山里有三牌三七丹參片對小鼠微核率的影響

1.3.4 小鼠精子畸形實驗

1.3.4.1 實驗動物

選用健康、成熟，體重25～30g雄性小鼠25只。小鼠隨機分成 5組，各組5只。

1.3.4.2 劑量和給藥方法

實驗設2.5、5.0、10.0 g/kg BW三個劑量組，分別稱取樣品5.0、10.0、20.0g，以1%羧甲基纖維素鈉為溶媒分別配制成40ml樣品液。另設一個陰性對照組（1%羧甲基纖維素鈉）和一個陽性對照組（絲裂霉素C 1.5mg/kgBW,稱取絲裂霉素C1.5mg，加生理鹽水溶解至20ml備用）。小鼠按20ml/kgBW灌胃容量經口灌胃給予受試物，連續5天，每天1次。于首次灌胃后第35天頸椎脫臼處死動物，取兩側附睪，制成吸濾液直接涂片，自然干燥，甲醇固定，1%伊紅染色。

1.3.4.3 觀察指標

高倍鏡下觀察精子形態并計數，每只小鼠計數完整精子1000條，計算精子畸形發生率 （%)。數據用SPSS統計軟件進行統計分析。

1.3.4.4 小鼠精子畸形實驗結果

山里有三牌三七丹參片對小鼠精子畸形發生率的影響見表4。與陰性對照組比較，各劑量組小鼠精子畸形發生率均無顯著性差異（P＞0.05)；陽性對照組則明顯高于陰性對照組，其差異有顯著性意義 （P＜0.01)，本實驗條件下，未見山里有三牌三七丹參片對小鼠精子畸形發生率產生明顯影響，本次檢測結果為陰性。

表4 山里有三牌三七丹參片對小鼠精子畸形發生率的影響

2 結論

山里有三牌三七丹參片遺傳毒性實驗：Ames實驗、小鼠骨髓細胞微核實驗和小鼠精子畸形實驗結果均為陰性，該樣品未顯示有致突變型。山里三牌三七丹參片小鼠經口急性毒性最大耐受量（MTD），雌雄兩性均大于20.0g/kgBW，按急性毒性分級標準判定，該樣品屬無毒級。