“鮮人參膏”對APAP致小鼠肝損傷的保護作用

沙紀越 ，李健豪 ，林向輝 ，劉喜峰 ，林曉熙 ，劉 偉 ，李 偉

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春130118 2.遼寧熙峰藥業(yè)集團有限公司，桓仁117000)

對乙酰氨基酚（APAP）又稱撲熱息痛，在臨床上廣泛應用于解熱和鎮(zhèn)痛[1～2]，在治療劑量范圍內(nèi)相對安全，但在大量臨床數(shù)據(jù)監(jiān)測表明過量的APAP會導致嚴重的副作用，最常見的會導致不可逆肝毒性[3]。APAP在數(shù)百種處方藥和非處方藥中的廣泛應用，導致了大量患者因此而受到傷害[4～5]。

人參為五加科人參屬植物人參（Panax ginseng C.A.Meyer）的干燥根及根莖，是歷史悠久的特色中草藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，可安神益智，生精養(yǎng)血，復脈固脫，久服輕身延年，享有“百草之王”的美譽[6～8]。人參的主要活性成分為人參皂苷，具有抗腫瘤、降低化療藥物的心臟毒性和肝毒性、保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)、抗疲勞、降血糖、修復創(chuàng)面等廣泛藥理作用[9～11]。隨著人參的多重功效被證實，為了更好地開發(fā)利用人參的藥用價值，人們開始對人參進行深加工，并開發(fā)了一系列的人參加工制品[12]。

膏劑，屬于中醫(yī)傳統(tǒng)劑型之一[13]。膏劑一般由多味中藥組成，將藥物用水或植物油煎熬濃縮而成的膏狀劑型[14]，常采用通補兼施，動靜結(jié)合的方法，更易于人體吸收，兼具治療和滋補的特點。鮮人參膏（Fresh Ginseng Paste,FGP）精選自然生長于林間的5年生優(yōu)質(zhì)新鮮林下參，配以優(yōu)質(zhì)紅棗精華，采用世界先進的冷鏈工藝技術(shù)，鮮人參原漿提取，經(jīng)專利配方及多道殺菌工序秘制而成，可充分保留了人參活性成分和營養(yǎng)物質(zhì)。利用獨有的專利技術(shù)[15]，全成分使用新鮮人參，在最大限度保留天然原生皂苷的同時，創(chuàng)造性的生成以R-Rg3為代表的16種稀有人參皂苷組分群和氨基酸、人參多糖、人參蛋白等18種活性物質(zhì)。同時，通過酶促反應增加美拉德反應產(chǎn)物精氨酸雙糖苷AFG的生成。

人參加工產(chǎn)品由于其富含人參皂苷并具有顯著的生理活性，更易于消化吸收，一直是國內(nèi)外學者研究的熱點，研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷還具有抗高脂血癥及清除氧自由基的作用[16～17]，本文首次利用人參加工品“鮮人參膏”探討其對APAP誘導小鼠肝損傷的保護作用及其可能機制，為深度開發(fā)人參類加工產(chǎn)品及對肝損傷保護治療劑提供理論依據(jù)和物質(zhì)參考。

1 材料與方法

1.1 HPLC檢測FGP中人參皂苷分析

精密稱取人參總皂苷標準品5 mg，加甲醇配置成人參皂苷的質(zhì)量濃度分別為1.00 mg/mL的對照品溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過。精密稱取FGP 5 g，加入50 ml甲醇，超聲30 min，濃縮后加甲醇定容至10 ml經(jīng)0.22 μm濾膜濾過作為待測品溶液，取部分樣品進行HPLC分析，色譜柱為C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫 30 ℃，檢測波長 203 nm，流動相乙腈（A）-水（B）梯度洗脫（0～20 min，18.5%～20.5%A；20～30 min，20.5%～25.5%A；30～40 min，25.5%～35%A；40～60 min，35%～45%A；60～70 min，45%～60%A；70～80 min，60% ～70%A；80 ～90 min，70% ～80%A；90 ～91 min，80%～18.5%A；91～95 min，18.5%A）， 流速 1.0 mL/min，進樣量 20 μL。

1.2 實驗動物

SPF級雄性ICR小鼠32只，體質(zhì)量22~25g，由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司提供，合格證號：SCXK（吉）2016-0003。動物飼養(yǎng)條件符合實驗動物福利倫理委員會的要求，小鼠自由進食和飲水，室溫23.0±2.0℃，濕度55%~65%，明暗交替12h的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)，飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.3 藥品和試劑

鮮人參膏（Fresh Ginseng Paste,FGP），遼寧熙峰藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)，合格證號：SC10721052200667；APAP（質(zhì)量分數(shù)＞98%，批號：D1513003，阿拉丁試劑有限公司）；蘇木素-伊紅染液（H&E），丙氨酸轉(zhuǎn)移酶 （ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙二醛（MDA）及谷胱甘肽（GSH）試劑盒，購于南京建成生物工程有限公司；乙腈，TEDIA公司；色譜純甲醇（MEOH）、乙醇（ETOH），北京化工廠，分析純；水為超純水，所有其他試劑均為分析級。

1.4 儀器

PL303電子天平，上海梅特勒托利多儀器有限公司；HC-2517高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；拓宇衡器電子天平，沈陽拓宇衡器有限公司；T10高速組織勻漿機，德國IKA；SPECTRO star Nano全波長掃描式酶標儀，德國BMG LABTECH公司；顯微鏡Leica DM 500和Leica DM 2500熒光顯微鏡，德國徠卡。

1.5 動物分組和給藥

將ICR小鼠進行適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為4組（n=8）；FGP 藥品置于羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液中分別配置成低劑量組（400 mg/ml）和高劑量組（800 mg/ml），正常對照組和模型組給予同樣劑量的生理鹽水。各組在給藥前均稱量小鼠體重，以調(diào)整給藥劑量。所有小鼠連續(xù)給藥7天。其中第7天給藥1h后，模型組、FGP低、高劑量組一次性腹腔注射APAP 250 mg／kg-1，24 h后眼球取血，血液室溫凝結(jié) 1 h后4℃離心 （3 500 r/min，10 min），取上清供血清指標ALT和AST檢測。取肝臟組織溶于生理鹽水中制成肝勻漿用于檢測GSH和MDA水平，取相同部位的肝組織固定于10%甲醛中，用于肝組織切片觀察病理變化。

1.6 體質(zhì)量變化和臟器系數(shù)的測定

計算實驗結(jié)束前與給藥前小鼠體質(zhì)量的差值，記為體質(zhì)量變化值。小鼠處死后立即取新鮮肝組織稱重，并計算肝指數(shù)=(肝質(zhì)量/體質(zhì)量)×100。

1.7 H&E染色

將肝組織固定于 10%甲醛中，石蠟包埋切片，將切片放入二甲苯中脫蠟30 min，再放入無水乙醇中30 min，依次放入 95%、70%、50%乙醇中 3 min水化，最后放入蒸餾水中 5 min，加入蘇木素，1 min后流水沖洗返藍，返藍后依次放入50%、70%、95%乙醇中各3 min，滴加伊紅，1 min后放入無水乙醇，5 min后放入二甲苯中保持 30 min，滴加樹脂，蓋玻片封片，光鏡下觀察肝組織切片的病理變化。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 HPLC法檢測FGP中化學成分分析

經(jīng)HPLC法在FGP中檢測到22種人參皂苷類成分：Rg1,Re,Rb1,Rc,Rb2,Rd,(S)-Rg2,(R)-Rg2,(S)-Rh1,(R)-Rh1,Rg6,F4,Rk3,Rh4,(S)-Rg3,(R)-Rg3,Rk1,Rg5,(S)-Rh2,(R)-Rh2,原人參二醇(PPD),原人參三醇(PPT).等（圖1），其中稀有人參皂苷總含量大于620 mg/100g。

圖1 HPLC色譜圖：人參總皂苷標品（A）和FGP（B）。1：Rg1 2：Re 3：(S)-Rg2 4：(R)-Rg2 5：(S)-Rh1 6：(R)-Rh1 7：Rb1 8：Rc 9：Rb2 10：Rd 11：Rg6 12：F4 13：Rk3 14：Rh4 15：(S)-Rg3 16：(R)-Rg3 17：Rk1 18：Rg5 19：(S)-Rh2 20：(R)-Rh2 21：PPT 22：PPD

2.2 FGP對APAP致肝損傷小鼠體重及臟器系數(shù)的影響

正常對照組小鼠生長情況良好，毛順色亮，體質(zhì)量增加。與正常對照組相比，APAP組毛色成縷，毛發(fā)無光，體質(zhì)量有明顯減輕，并無小鼠死亡，脾臟系數(shù)有顯著降低（P＜0.01），肝臟系數(shù)有顯著升高（P＜0.05），充分表明小鼠的肝受到損傷。與APAP組相比，F(xiàn)GP低劑量組（400mg·kg-1）和高劑量組（800mg·kg-1）小鼠毛色明顯好轉(zhuǎn)，體質(zhì)量下降得到緩解，低劑量組（400 mg·kg-1）脾系數(shù)降低以及高劑量組（800mg·kg-1）肝系數(shù)升高的幅度都得到明顯改善（P＜0.05）。

表1 .FGP對APAP誘導的急性肝損傷小鼠器官指數(shù)的影響

2.3 FGP對小鼠血清指標的影響

ALT和AST是肝損傷的主要酶標記物，當肝細胞受到損傷時，這些標記物會從肝臟滲漏到血液中，從而導致二者血清濃度急劇升高。如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中ALT和AST的水平顯著升高（P＜0.05），GFA低、高劑量組能夠明顯抑制血清中 ALT和 AST水平的升高（P＜0.05），且存在一定的劑量效應關(guān)系。初步說明FGP對APAP所致的肝損傷具有一定的保護作用。

圖2 .FGP對APAP誘導的急性肝損傷小鼠血清ALT和AST水平的影響。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±S.D.，n=8.**P﹠0.01，相對于正常組;與順鉑組相比，#P﹠0.05，##P﹠0.01

2.4 FGP對小鼠肝臟中GSH和MDA的影響

為進一步說明FGP的藥理作用，我們對小鼠肝臟內(nèi)的GSH和MDA水平進行檢測，如圖3所示，模型組中小鼠肝組織勻漿中的GSH水平明顯低于對照組（P﹠0.05,P﹠0.01），而低、高劑量的FGP顯著地抑制了GSH水平的降低。另外，MDA水平能充分說明組織的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的多少，直接說明細胞受損程度[18]。結(jié)合本實驗可知，與對照組比較，模型組的MDA量明顯升高（P﹠0.05,P﹠0.01），F(xiàn)GP低、高劑量組則明顯抑制了肝組織中MDA水平的升高。以上數(shù)據(jù)說明FGP能夠提高肝組織抗氧化能力以及減緩APAP對肝細胞產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化作用。

圖3 .FGP對APAP誘導的急性肝損傷小鼠肝臟GSH和MDA水平的影響。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±S.D.，n=8.**P﹠0.01，相對于正常組;與順鉑組相比，#P﹠0.05，##P﹠0.01

圖4 .FGP對APAP誘導的急性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響

2.5 FGP對小鼠肝組織病理變化影響

如圖4所示，對照組小鼠肝組織細胞排列整齊且形態(tài)正常。模型組肝組織中央靜脈附近細胞大面積壞死，壞死處可見無核肝細胞殘體，肝竇擴張充血，伴有部分細胞變性腫脹和細胞炎性浸潤，部分凋亡細胞有明顯的點狀和灶狀壞死。FGP低、高劑量組細胞壞死程度減輕，炎性細胞浸潤減輕，F(xiàn)GP高劑量組細胞壞死顯著減輕，肝細胞排列比較規(guī)律。

3 討論

研究結(jié)果顯示，APAP誘導小鼠血清中 AST和ALT水平顯著升高、肝組織中GSH水平降低和 MDA水平升高，使肝細胞腫脹，排列疏松，細胞核部分消失或壞死，說明造模成功；FGP低、高劑量組與模型組相比，血清中 AST、ALT水平降低，肝組織中 GSH升高和MDA水平降低，顯示FGP可以緩解APAP造成的肝損傷。 研究表明，當肝組織損傷時，細胞中產(chǎn)生大量 N-乙酸-對苯醌亞胺（NAPQI），與 GSH 結(jié)合，導致GSH量下降，細胞中超氧負離子歧化作用導致大量活性氧生成，對細胞產(chǎn)生氧化應激作用[19]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)GP低、高劑量組中 GSH量升高，MDA量降低，說明 FGP具有明顯的抗氧化作用。由H&E染色結(jié)果可知，模型組肝細胞壞死、腫脹，部分細胞發(fā)生炎性浸潤，F(xiàn)GP低、高劑量組細胞壞死程度減輕，炎性細胞浸潤減輕，進一步說明FGP能顯著抑制細胞凋亡。本研究采用新型的人參加工品“鮮人參膏”，通過APAP所致的肝損傷，對FGP的藥效學研究進行探索，初步揭示FGP對APAP誘導肝損傷具有保護作用，其可能的機制與抑制氧化應激和細胞凋亡，減少炎癥反應有關(guān)。本研究進一步拓寬藥食同源藥材的使用范圍，為人參及相關(guān)產(chǎn)品的深度開發(fā)提供物質(zhì)參考，并結(jié)合藥效學研究為FGP臨床應用提供理論依據(jù)。