骨硬化蛋白單克隆抗體單用與聯合黃芪對去卵巢誘導的骨質疏松療效比較

孫帥波，陳少敏，林晉體，周呈偉，水小龍

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院，浙江 溫州 325027，1.骨科；2.康復科）

骨質疏松癥是一種骨密度降低，骨顯微結構改變從而導致骨骼的強度下降，易導致骨折的一種骨骼疾病[1-2]。近年來骨質疏松患者逐年增加，骨質疏松相關性骨折已成為一大難題，對臨床醫師來說防治骨質疏松已經是一項艱巨而富有挑戰的任務[3-4]。研究發現可以使用骨硬化蛋白單克隆抗體（sclerostin-antibody，Scl-Ab）拮抗骨硬化蛋白引起的骨形成負向調節作用[5]，從而抑制骨丟失來治療骨質疏松，其療效較好[6-7]。但大量長期使用Scl-Ab后可能出現一些并發癥，還可能刺激機體產生針對Scl-Ab的相關抗體，使藥物療效降低[8]。研究顯示黃芪（Astragalus membranaceus）可以使血清鈣、磷、骨鈣素及堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平顯著升高。黃芪還可以減少雌激素下降所引起的骨質疏松癥患者的骨量丟失，其機制主要是通過減少骨質破壞、增加骨形成、抑制骨吸收從而達到骨量的增加[9-10]。本研究比較Scl-Ab聯合黃芪與單用Scl-Ab治療去卵巢誘導的骨質疏松的療效。

1 材料和方法

1.1 材料 Scl-Ab（美國MSD公司）、黃芪液（從膜莢黃芪中提取）[11]、手術操作器械（美國Stryker醫療器械公司）、Micro-CT（型號SkyScan1176，荷蘭）。硬組織切片機（型號EXAKT300，德國）、鈣黃綠素及四環素（美國Sigma公司）、Image-Pro Plus圖像分析儀（美國Media Cybernetics公司）、顯微鏡（ZEISS Axio Imager M1，德國）。

1.2 方法

1.2.1 建立骨質疏松動物模型及治療：3～4個月齡健康雌性SD大鼠30只，體質量200～240 g。從上海斯萊克實驗動物公司購入，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2007-005。30只大鼠隨機分為手術組（OVX組，n=25）和假手術組（Sham組，n=5）。手術前30只大鼠均稱體質量，根據體質量以10%水合氯醛3 mL/kg進行腹腔注射麻醉，麻醉起效后再在大鼠背側正中線中下1/3處行一長約2 cm縱行切口，逐層鈍性分離皮下組織至脊柱旁開0.5 cm處，撥開肌肉組織、顯露卵巢，OVX組輕提卵巢結扎輸卵管卵巢交界處，切下雙側卵巢，然后縫合關閉創口，Sham組直接縫合關閉創口。術后3 d給予肌注青霉素（2.5萬U/kg）預防感染。正常飼養12周后2組各取5只大鼠處死并取股骨行Micro-CT檢測，用于檢測骨質疏松動物模型是否建立。建模成功后將剩下的OVX組大鼠隨機的分成2組：Scl-Ab組、Scl-Ab+黃芪組。Scl-Ab組：給予Scl-Ab皮下注射（25 mg/kg，每周2次），并且每天給予200 mg/kg 0.9氯化鈉溶液灌胃，直至12周[11-12]；Scl-Ab+黃芪組：Scl-Ab皮下注射（12.5 mg/kg，每周2次），同時每天給于200 mg/kg黃芪液灌胃，直至12周。每周稱體質量并調整藥物劑量。分別在治療第71天和第81天，所有大鼠腹腔注射鈣黃綠素及四環素（15 mg/kg）[13]。

1.2.2 Micro-CT檢測：藥物治療12周后處死大鼠，取下所有大鼠雙側股骨，剔除軟組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗后，馬上用4%的多聚甲醛固定用于Micro-CT檢測。將左側股骨置于儀器上，股骨遠端骺線下方為掃描興趣區。CT掃描后進行3D重建，在去除骨皮質影像圖案后進行定量分析。獲得大鼠股骨遠端骺線下方檢測區域骨微結構參數：骨體積分數（bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb．Th）、骨小粱分離度（trabecular spacing，Tb．Sp）、骨小粱數量（trabeculae number，Tb．N）、連接密度（connective density，Conn.D.）及股骨骨密度（bone mineral density，BMD）。

1.2.3 硬組織切片：待所有股骨經過Micro-CT檢測后，用4%多聚甲醛固定所有標本，梯度乙醇脫水，甲基丙烯酸甲酯包埋。隨后用硬組織切片機沿股骨縱軸冠狀面將組織包埋塊進行切片，切片厚度為30～40 μm左右；隨后進行清洗、打磨、拋光、Masson染色，使用光鏡及熒光顯微鏡觀察鈣黃綠素條帶，并用Image-Pro Plus 6.0全自動圖像分析儀計算骨礦化沉積率（mineralization deposition rate，MAR）。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，計量資料且符合正態分布用來表示，2組計量資料間比較用成組t檢驗，計數資料比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠骨質疏松模型的構建 術后12周大鼠的Micro-CT檢測結果，Sham組骨小梁更粗，骨質也更加緊密，股骨BMD為（230.89±27.63）mg/cm2，而OVX組為（158.24±25.67）mg/cm2。與Sham組比，OVX組大鼠的BMD降低，差異有統計學意義（P＜0.05），表明建模成功，見圖1。

2.2 2組大鼠BMD的比較 Scl-Ab組和Scl-Ab+黃芪組各1只大鼠因麻醉過量、手術創傷和傷口感染死亡；最終共18只大鼠進入檢測評估。藥物使用12周時大鼠股骨的Micro-CT檢測，Scl-Ab組股骨BMD為（176.78±28.23）mg/cm3，Scl-Ab+黃芪組股骨BMD為（215.79±27.86）mg/cm3；與Scl-Ab組比，Scl-Ab+黃芪組骨量增多，骨質更緊密，股骨BMD增加了22.07%，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 2組Micro-CT三維重建圖像分析及骨微觀參數的比較 Scl-Ab+黃芪組Tb.N的數量要明顯多于Scl-Ab組，而且骨小梁更粗、聯系緊密，見圖2。與Scl-Ab組比，骨微觀參數也顯示Scl-Ab+黃芪組有更高的BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D和更低的Tb.Sp，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.4 2組硬組織切片結果的比較 治療12周后Scl-Ab+黃芪組硬組織切片中股骨遠端Tb.N的量明顯多于Scl-Ab組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且骨小梁排列更有規律、更緊密。熒光共聚焦顯微鏡下觀察進一步證實了Micro-CT的結果。用熒光共聚焦顯微鏡經Image-Pro Plus 6.0計算Scl-Ab組MAR為（0.80±0.09），Scl-Ab+黃芪組為（1.56±0.10），2組間差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖2 2組大鼠股骨干骺端Micro-CT三維重建結果

表1 治療12周時2組大鼠左股骨干骺端骨微觀參數比較（每組n=9，

表1 治療12周時2組大鼠左股骨干骺端骨微觀參數比較（每組n=9，

與Scl-Ab組比：aP＜0.05

Scl-Ab+黃芪組 2.987±0.115a 0.174±0.016a 0.401±0.013a 0.345±0.037a 89.421±13.564a Scl-Ab組 2.270±0.090 0.123±0.011 0.198±0.016 0.610±0.129 46.723± 9.120

圖3 用藥物12周時Scl-Ab組和Scl-Ab+黃芪組大鼠股骨干骺端Masson染色和股骨四環素-鈣黃綠素標記結果

3 討論

引起絕經后骨質疏松的主要原因是雌激素的缺乏，屬于高轉化型[14]。雌激素的不足使得成骨和破骨的平衡被打破，會直接影響骨質，最終可能導致病理性骨折[15-16]。目前用于治療骨質疏松的藥物很多，但都有自身的局限性。如二膦酸鹽類人體吸收率低，腎功能不全的患者者或有血栓栓塞性疾病的患者不適合使用；甲狀旁腺素類使用不方便，且不能用于骨骺線尚未閉合的兒童及青少年患者[17]；地諾單抗則容易導致下頜骨壞死[18]。Scl-Ab是一種非常有潛力的藥物，目前治療效果較好[19]。但也有人提出Scl-Ab存在一定不良反應，可能發生同Van Buchem病和骨硬化病類似的癥狀，如因為顱骨增生從而壓迫到顱神經、脊柱椎管狹窄癥或者椎間孔增生壓迫到周圍神經等癥狀。另一方面，臨床前期實驗發現，使用Scl-Ab后受試者體內的血清鈣會輕度降低，甲狀旁腺素會隨之代償性升高，血清鈣又會回到正常值。這種情況對于普通患者的風險較低，但如果是腎臟疾病或維生素D缺乏癥的患者則存著一定風險。同時對一些免疫系統紊亂的患者來講，可能會影響Scl-Ab的藥代動力學或增加藥物毒性，又或者可能使機體產生相應的抗體，降低藥效[10]。

黃芪為蒙古黃芪、膜莢黃芪的根，性微溫，味甘，歸肺脾經，助氣，壯筋骨，具有健脾補中、益氣固表、升陽舉陷、斂汗固脫之功[20]。文獻記載黃芪還具有補腎作用，也有防治骨量丟失及骨質疏松的作用[21]。黃芪可以顯著提高血中磷、鈣、骨鈣素及ALP。

本研究通過對大鼠去勢來建立骨質疏松模型，一般狀況下飼養3個月后經Micro-CT檢測股骨BMD及骨量減少情況來確定骨質疏松建模是否成功。通過黃芪和Scl-Ab的聯合使用和Scl-Ab單獨使用分別來治療去卵巢誘導的骨質疏松，藥物治療12周后處死所有大鼠并取股骨行硬組織切片、Micro-CT等評估。研究發現，在用藥12周后Scl-Ab+黃芪組可以看見更多的骨小梁，且小梁之間排列更整齊、更緊密，而Scl-Ab組相對來講股骨干骺端骨小梁排列較稀疏，且部分骨小梁之間聯系欠緊密。用Micro-CT測定各組的BMD發現Scl-Ab+黃芪組要明顯高于Scl-Ab組。Scl-Ab+黃芪組與Scl-Ab組相比較，BV/TV、Tb.N、Tb.Th都增高，而Tb.Sp降低；Scl-Ab+黃芪組的MAR也明顯高于Scl-Ab組，這表明黃芪和Scl-Ab的聯合使用相較于單用Scl-Ab可以明顯增加去勢大鼠股骨BMD，提高股骨干骺端骨小梁的質量，加速骨質的礦化，對提高骨量效果更顯著。

本研究提示黃芪和Scl-Ab的聯合使用相較于單用Scl-Ab在抗骨質疏松方面效果更好。聯合應用黃芪可以降低Scl-Ab的使用量，有助于降低使用Scl-Ab時所帶來的不良反應，并且提高了治療效果。