沉默信息調節因子3在丹酚酸A抗紫外線誘導視網膜色素上皮細胞氧化應激性損傷中的作用及機制

李霞，王彥方，陳戰巧，俞頌平

（溫州醫科大學附屬第五醫院 眼科，浙江 麗水 323000）

老年性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是一種以布魯赫膜和視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）之間玻璃膜疣堆積為特征、以視力不可逆性下降為表現的老年性眼部疾病[1]。研究認為AMD的發生與新生血管形成、炎癥反應、氧化應激性損傷、自身免疫反應等有關[1]。過度紫外線照射已被認為是AMD發生的外在因素，能夠誘發RPE細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加，激發細胞內氧化應激性損傷，且清除細胞內ROS，能夠有效降低紫外線誘導的RPE損傷[2-3]。我們前期研究證實丹酚酸A（salvianolic acid A，Sal A）作為一種氧化清除劑[4-5]，對紫外線誘導RPE氧化應激性損傷具有保護作用[3]，但其具體分子機制仍未完全明確。沉默信息調節因子3（silent information regulator 3，SIRT3）是一種NAD+依賴的 III型組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC），在人類RPE細胞中呈高表達，參與RPE的多種生物學功能，尤其與RPE氧化應激損傷密切相關[6]。本研究進一步探討SIRT3在Sal A抗紫外線誘導的ARPE-19細胞損傷的分子機制，為應用Sal A預防和治療AMD提供科學根據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 Sal A（貨號：96574-01-5）購自上海阿拉丁公司，DMEM培養基、青霉素-鏈霉素雙抗、FBS、胰蛋白酶購自英國Gibco公司，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽、二甲基亞砜購自美國Sigma公司；SIRT3、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）、Bax、bcl-2、cleaved-Caspase3、Cyt c和β-actin單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。ROS檢測試劑盒購自北京Solarbio公司，CuZn/Mn-SOD活性檢測試劑盒（WST-8法）和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術公司，si-SIRT3、si-RNA購買于美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養與分組 將人ARPE-19細胞（購自中國科學院細胞庫）培養種植于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，取對數生長細胞進行實驗。取1×105接種于96孔板或1×106個細胞接種于6孔板中，將ARPE-19細胞按照不同處理條件分組：對照（Sal A）組、UV（30 mJ/cm2紫外線照射）組、5 μmol/L Sal A（5 μmol/L Sal A預處理30 min后30 mJ/cm2紫外線照射）組、25 μmol/L Sal A（25 μmol/L Sal A預處理30 min后30 mJ/cm2紫外線照射）組、50 μmol/L Sal A（50 μmol/L Sal A預處理30 min后30 mJ/cm2紫外線照射）組。

1.3 細胞轉染 按細胞密度為5×105個/孔接種于6孔板，待細胞融合至80%左右時，將5 μL陰性si-RNA和si-SIRT3質粒與5 μL Lipofectamine 2000試劑（美國Invitrogen公司）混合于200 μL無FBS、無雙抗培養基，加入ARPE-19細胞，置于37 ℃培養箱中過夜，次日更換含有10% FBS、雙抗的新鮮培養基，繼續培養48 h。按照轉染情況將細胞分為對照（Sal A）組、UV（30 mJ/cm2紫外線照射）組、Sal A+UV（50 μmol/L Sal A預處理30 min后30 mJ/cm2紫外線照射）組、Sal A+UV+陰性si-RNA（經si-RNA質粒轉染細胞，用50 μmol/L Sal A預處理30 min后，30 mJ/cm2紫外線照射）組、Sal A+UV+si-SIRT3（經si-SIRT3質粒轉染，用50 μmol/L Sal A預處理30 min后30 mJ/cm2紫外線照射）組。

1.4 細胞活性檢測 將1×105個ARPE-19細胞接種于96孔板中，按照分組方法處理，并繼續培養48 h后，每孔加入20 μL 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，37 ℃恒溫箱孵育4 h，棄去上清液，加入二甲基亞砜120 μL終止反應。酶標儀中檢測各孔的吸光光度（A）值，計算細胞存活率。細胞存活率=實驗組A/對照組A×100%。

1.5 細胞凋亡檢測 取1×106個細胞接種至6孔板中，經處理48 h后，收集細胞懸液，以1 500 r/min離心，棄上清，再次重懸、離心、棄上清后，加入500 μL緩沖液，吹散細胞。將5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI依次加入、混勻，室溫下避光孵育15 min，上機檢測。

1.6 ROS水平檢測 采用DCFH-CA方法檢測細胞內ROS水平。將細胞密度為1×106個/孔的ARPE-19接種于6孔板，經處理48 h后，按照ROS檢測試劑盒說明書進行操作。用終濃度為10 μmol/L的DCFH-CA重懸細胞，置入37 ℃細胞培養箱內孵育20 min，以無血清細胞培養液洗滌3次后，轉至流式細胞儀檢測平均熒光強度。

1.7 SOD2活性檢測 采用WST-8法檢測細胞內SOD2活性。將細胞密度為1×106個/孔的ARPE-19接種于6孔板，經處理后，預冷的PBS洗滌2次。收集細胞，加入預冷的PBS勻漿，取勻漿液4 ℃離心，收集上清液。經BCA法進行蛋白定量后備用。按照CuZn/Mn-SOD活性檢測試劑盒（WST-8法）說明書配制WST-8/酶液和反應啟動液。取20 μL樣品，依次加入160 μL WST-8/酶液和20 μL反應啟動液，37 ℃孵育30 min。在波長為450 nm時，測定吸光度。

1.8 Western blot檢測 各組細胞用預冷PBS漂洗3次后，加入150 μL RIPA細胞裂解液，冰上裂解15 min，EP管收集細胞裂解液，置于4 ℃離心機，12 000 r/min離心15 min，取上清。按照BCA蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量，取20 μg總蛋白用聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離，電轉至PVDF膜上；經3%脫脂奶粉封閉1 h，加入適量比例的SIRT3、SOD2一抗，置于4 ℃冰箱過夜。用 PBST緩沖液洗膜后，按1：20 000加入HRP標記的二抗室溫孵育2 h。再次洗膜后，用ECL試劑顯影。

1.9 RT-qPCR檢測 總RNA用Trizol試劑（美國Invitrogen公司）抽提，即加入1 mL Trizol試劑吹下細胞，加入200 μL氯仿，EP管內靜置15 min后，置于4 ℃離心機，12 000 r/min離心15 min。取上清，用1 mL 75%乙醇洗滌，再次離心，棄上清、干燥后，取RNA沉淀物。mRNA反轉錄反應，按照PrimeScript RT Master Mix（大連Takara公司）說明書合成cDNA。進行PCR檢測，將反轉錄物用SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒（大連Takara公司）在ABI500 PCR儀上進行RT-qPCR擴增、檢測。SIRT3引物：上游5’-CGCTAAACTTCTCCCGGGTT-3’，下游5’-ACACTAGTCCT CGCCAAACG-3’；SOD2引物：上游5’-GCCTCCCTGACCTG CCTTAC-3’；下游： 5’-GTGATTGATATGGCCCCCG-3’；GAPDH引物：上游5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；使用2-△△CT法分析SIRT3、SOD2 mRNA表達情況。

1.10 統計學處理方法 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。數據以s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Sal A抑制紫外線誘導SIRT3表達 與對照組比，UV組SIRT3表達量明顯降低（P＜0.05）；與UV組比，5、25、50 μmol/L Sal A處理后，細胞內SIRT3表達量明顯增加（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Sal A抗UV抑制SIRT3蛋白和mRNA的表達

2.2 SIRT3在Sal A抗紫外線誘導RPE細胞損傷的作用 與對照組相比，UV組細胞存活率明顯下降（P＜0.05）；與UV組相比，Sal A+UV組細胞存活率明顯增加（P＜0.05）；與Sal A+UV組相比，Sal A+陰性si-RNA+UV組細胞存活率差異無統計學意義（P＞0.05），Sal A+UV+si-SIRT3組細胞存活率明顯降低（P＜0.05）；與Sal A+陰性si-RNA+UV組相比，Sal A+UV+si-SIRT3組細胞存活率明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

2.3 SIRT3在Sal A抗紫外線誘導ARPE-19細胞凋亡的作用 與對照組相比，UV組細胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、Cyt c表達量增加，Bcl-2表達量下降（P＜0.05）；與UV組相比，Sal A+UV組細胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、Cyt c表達量降低，Bcl-2表達量增加（P＜0.05）；與Sal A+UV組相比，Sal A+陰性si-RNA+UV組細胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、Cyt c表達量降低（P＜0.05），Bcl-2表達量差異無統計學意義（P＞0.05），Sal A+UV+si-SIRT3組細胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、Cyt c表達量降低，Bcl-2表達量明顯增加（P＜0.05）；與Sal A+陰性si-RNA+UV組相比，Sal A+UV+si-SIRT3組細胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、Cyt c表達量明顯增加，Bcl-2表達量下降（P＜0.05）。見圖3。

2.4 SIRT3在Sal A抗紫外線誘導ARPE-19細胞氧化應激的作用 與對照組相比，UV組ROS水平升高，SOD2活性、蛋白和mRNA表達下降（P＜0.05）；與UV組相比，Sal A+UV組ROS水平降低，SOD2活性、蛋白和mRNA表達量增加（P＜0.05）；與Sal A+UV組相比，Sal A+陰性si-RNA+UV組ROS水平、SOD2活性、蛋白和mRNA表達量無明顯差異（P＞0.05），Sal A+UV+si-SIRT3組ROS水平升高，SOD2活性、蛋白和mRNA表達量下降（P＜0.05）；與Sal A+陰性si-RNA+UV組相比，Sal A+UV+si-SIRT3組ROS水平增加，SOD2活性、蛋白和mRNA表達降低（P＜0.05）。見圖4。

圖2 SIRT3在Sal A抗UV抑制細胞存活的作用

3 討論

圖3 SIRT3在Sal A抗UV誘導細胞凋亡的作用

圖4 SIRT3在Sal A抗UV誘導氧化應激的作用

SIRT3定位于線粒體基質，能促使多種抗氧化物酶去乙酰化，調節細胞內氧化應激，維持細胞正常生理功能[7]。SIRT3高表達于視網膜組織，主要分布于內外叢狀層和視網膜色素上皮細胞[6，8]，參與抵抗細胞氧化應激損傷和視網膜血管新生的調控[9-10]。研究發現胰高血糖素樣肽I類似物能夠增加SIRT3的表達，抑制過氧化氫誘導的R28細胞損傷作用[11]。本研究發現UV照射后，細胞存活率下降，細胞凋亡，Bax、cleaved-Caspase3、cyt c表達量增加，而SIRT3、Bcl-2表達量顯著下降；經Sal A預處理后，細胞存活率增加，細胞凋亡，cleaved-Caspase3、Cyt c表達量下降，SIRT3、Bcl-2表達量顯著增加；用si-SIRT3干擾后，Sal A抗UV誘導細胞損傷的作用明顯減弱，表現為：與Sal A+UV組相比，Sal A+si-SIRT3+UV組細胞存活率下降，細胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、cyt c表達量增加，Bcl-2表達量下降；提示Sal A的抗UV誘導的細胞損傷與其增加SIRT3表達有關。

SOD2作為位于線粒體的抗氧化物酶，能夠將超氧離子轉化成過氧化氫和水，維持細胞內ROS平衡[12]。SIRT3能直接與SOD2的乙酰化位點結合，使SOD2去乙?；黾覵OD2活性，形成SIRT3-SOD2通路，是重要的抗氧化通路[13-15]。QIU等[14]發現SIRT3使SOD2去乙?；?，增加細胞對氧化應激性的耐受性。CHEN等[15]表明木褪黑素能夠激活SIRT3介導的SOD2活性，降低細胞內ROS水平。LIU等[16]證實外源性增加SIRT3表達，SOD2的賴氨酸68位點乙?；?，抵抗糖尿病氧化應激性損傷。本研究中，與UV組相比，Sal A+UV組SIRT3表達量明顯增加，SOD2活性、蛋白和mRNA表達量也明顯增加，提示Sal A增加SOD2活性及表達可能與其誘導SIRT3表達有關。經si-SIRT干擾后，與Sal A+UV組相比，Sal A+si-SIRT3+UV組的SOD2活性、蛋白和mRNA表達量均明顯下降，說明SIRT3可能是Sal A增加SOD2表達量和活性的關鍵靶點。

綜上所述，紫外線照射下，ARPE-19細胞內SIRT3表達量下降，SOD2的表達、活性降低，細胞氧化應激性損傷被激發，Sal A能夠增加細胞內SIRT3的表達量，進而增加SOD2的活性和表達量，抵抗UV誘導的氧化應激性損傷。