miR-17-5p在大鼠垂體泌乳素腺瘤MMQ細胞耐藥中的作用

管佳清，許家棟，王春勇，蘇志鵬，蔡霖，陳賢斌，鄭偉明

（溫州醫科大學附屬第一醫院 神經外科，浙江 溫州 325015）

垂體泌乳素腺瘤是臨床上最常見的垂體腺瘤類型，占垂體腺瘤的40%～66%，年發病率達6～10/10萬[1-2]。卡麥角林（cabergoline，CAB）和溴隱亭作為多巴胺受體激動劑（dopamine agonist，DAs），是目前臨床上治療垂體泌乳素腺瘤的首選藥物。而相比于溴隱亭，CAB具有臨床療效更好，不良反應更少且藥物的半衰期更長等特點，能夠有效地減小腫瘤體積和抑制泌乳素分泌[3-5]。然而，臨床上仍還有大約11%的泌乳素瘤患者對CAB治療耐藥[6]，這部分患者常因藥物治療無效而出現高泌乳素血癥和顯著的腫瘤占位性癥狀。垂體泌乳素腺瘤的耐藥是一個在臨床上亟待解決的問題。

微小RNA（microRNAs）家族由一系列長16～29 nt的非編碼單鏈RNA組成[7]，該類RNA能特異性結合靶基因mRNA的3'UTR位點，從而調節靶基因的表達[8]。研究證實，包括乳腺癌[9]、骨肉瘤[10]、胰腺癌[11]、骨髓瘤[12]在內多種惡性腫瘤的耐藥性都與miRNAs有關[13]。有研究表明miR-17-5p能促進結腸癌的發生和耐藥，從而降低癌癥患者的生存率[14]。我們前期的研究發現，miR-17-5p在耐受多巴胺受體激動劑治療的垂體泌乳素腺瘤中呈高表達[15]，但其在垂體泌乳素腺瘤耐藥中的作用仍不清楚。本研究通過體外建立miR-17-5p過表達和敲減的MMQ細胞模型，探討miR-17-5p在MMQ細胞耐藥性中的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞MMQ購自美國ATCC細胞庫（細胞證書：ATCC-CRL-10609）。CAB購自英國Tocris Bioscience公司（貨號：2664/10），CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所，PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）單克隆抗體購自美國Cell Signal Technology公司（貨號：9188S），GAPDH單克隆抗體購自美國Proteintech公司（貨號：10494-1-AP），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Thermo Fisher Scientific公司（貨號：K1622），SYBR Premix Ex Taq II購自日本TAKARA公司（貨號：RR820A），RNAiso for small RNA購自日本TAKARA公司（貨號：9753A），Mir-XTM miRNA First Strand Synthesis Kit購自日本TAKARA公司（貨號：638315），miRNA-17 mimic、miRNA-17 inhibitor及陰性對照購自上海吉瑪基因公司，PTEN慢病毒載體購自上海吉凱基因技術有限公司。轉染試劑Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司，miR-17-5p、U6、PTEN及GAPDH引物購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠垂體泌乳素腺瘤MMQ細胞的培養：使用含有2.5%的胎牛血清、15%的馬血清和1%青鏈霉素混合液的F-12K培養基培養，將MMQ細胞接種于培養瓶后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖率：調整MMQ細胞密度為6×104/mL，接種于96孔培養板，每孔終體積為100 μL，培養過夜，按照說明書分別加入miR-17-5p mimics、miR-17-5p inhibitor以及陰性對照，作用至不同計劃時間點后，加入10 μL CCK-8試劑溶液，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度細胞培養箱中孵育2 h后，在酶標儀450 nm波長處檢測OD值。細胞增殖率=［（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）］×100%。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞對CAB治療的反應：將轉染miR-17-5p mimics、miR-17-5p inhibitor及陰性對照24 h后的細胞株接種于96孔培養板中，細胞濃度為每孔6×103個，按50 μmol/L終濃度加入CAB藥物處理，以PBS作為陰性對照，置入細胞培養箱，作用至不同計劃時間點后，加入10 μL CCK-8，37 ℃、5% CO2、飽和濕度細胞培養箱孵育2 h后，在酶標儀450 nm波長處檢測OD值。

1.2.4 生物信息學分析和熒光素酶報告檢測：通過在線預測網站獲取miR-17-5p與潛在靶標PTEN的互補結合位點，隨后設計相應引物。以人基因組DNA為模板經PCR反應擴增人PTEN基因3’UTR序列，將反應產物與pGEMT載體經連接反應轉化擴增后構建野生型pGEMT-PTEN 3’UTR載體（命名為pGEMTPTEN 3’UTR-WT）。隨后按照點突變試劑盒說明書進行點突變PCR反應構建突變型pGEMT-PTEN 3’UTR載體（命名為pGEMT-PTEN 3’UTR-MUT）。將pGEMT-PTEN 3’UTR-WT或pGEMT-PTEN 3’UTR-MUT載體和pmirGLO載體分別用限制性核酸內切酶Pme I和Sal I雙酶切過夜，隨后將得到的純化的pmirGLO載體和pGEMTPTEN 3’UTR-WT/MUT片段連接轉化擴增得到野生型和突變型重組pmirGLO載體。將MMQ細胞接種于24孔細胞培養板，用Lipofectamine 2000試劑將100 nmol/L miR-17-5p mimics或miR-17-5p NC，分別與重組pmirGLO載體共轉染MMQ細胞，48 h后采用Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）檢測熒光素酶活性。

1.2.5 Western blot檢測：收集細胞后用1 mL PBS洗滌2次后，加入細胞裂解液冰上裂解后吸取上清。總蛋白量采用BCA試劑盒進行檢測定量后，取30 μg總蛋白10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后加入PTEN一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。次日用TBST緩沖液洗滌PVDF膜，加入二抗室溫孵育。最后用ECL試劑發光、顯影，并用Image Lab軟件進行分析。

1.2.6 RT-qPCR檢測：用Trizol法提取細胞總RNA，反轉錄合成相應cDNA，用RNAiso for small RNA試劑盒和Mir-XTM miRNA First Strand Synthesis Ki試劑盒提取miRNA并反轉錄合成相應cDNA，隨后進行熒光定量PCR，反應體系為20 μL，用GAPDH作為參考，引物序列見表1。

表1 定量PCR相關引物序列

1.3 統計學處理方法 采用SPSS22.0軟件進行處理，計量資料用表示，2組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-17-5p促進MMQ細胞增殖 通過轉染miR-17-5p mimics提高MMQ細胞中的miR-17-5p表達水平，RT-qPCR結果顯示經過轉染后的MMQ細胞中miR-17-5p相對表達量提高到原先的6.24倍（1.37±0.12 vs.8.54±0.58，P＜0.05），MMQ細胞的增殖率明顯高于對照。轉染后24 h，實驗組細胞較對照組細胞增殖率增加39.39%（174.8%±12.4% vs. 125.4%±13.1%，P＜0.05）。通過轉染miRNA-17 inhibitor降低MMQ細胞中的miR-17-5p水平，miR-17-5p相對表達量降低62.38%（1.01±0.13 vs. 0.38±0.09，P＜0.05）RT-qPCR結果提示MMQ細胞中miR-17-5p表達量顯著下降，MMQ細胞的增殖率明顯低于對照，轉染后24 h，實驗組較對照組減少35.09%（112.50±15.25 vs.173.33±14.75，P＜0.05）。見圖1。這些結果表明miR-17-5p促進MMQ細胞增殖。

圖1 miR-17-5p對MMQ細胞增殖的影響

2.2 miR-17-5p對CAB治療反應的影響 將轉染后的細胞應用CAB藥物處理，采用CCK-8法檢測細胞存活率。結果發現單純CAB處理組細胞相對活性為（47.50±1.23）%，miR-17-5p過表達后CAB處理組細胞相對活性為（68.67±3.85）%，其細胞活性較前者提高了44.57%（P＜0.05）。miR-17-5p敲減后CAB處理組相對活性為（37.36±1.98）%，單純CAB處理組細胞相對活性為（48.0±3.7）%，下降了22.17%（P＜0.05）。見圖2。這些結果表明miR-17-5p能提高MMQ細胞對CAB的耐受性。

圖2 miR-17-5p對MMQ細胞CAB耐藥性的影響

2.3 miR-17-5p對MMQ細胞PTEN表達的影響 通過生物信息學數據庫預測miR-17-5p的靶標基因，發現PTEN基因的3’UTR第276～第282位堿基存在miR-17-5p潛在結合位點（見圖3A）。熒光素酶報告提示，相較于陰性對照，PTEN野生型MMQ細胞的熒光素酶活性明顯降低，而PTEN突變型MMQ細胞的熒光素酶活性無明顯變化（見圖3B）。采用Western blot與RT-qPCR檢測miR-17-5p轉染前后MMQ細胞中PETN的表達，結果顯示，與陰性對照相比，miR-17-5p高表達的MMQ細胞中PTEN蛋白和mRNA表達量均明顯降低（P＜0.05），而miR-17-5p下調后的MMQ細胞中PTEN蛋白和mRNA表達量均明顯上升（P＜0.05）。見圖3C-D。這些結果表明miR-17-5p能抑制MMQ細胞PTEN的表達。

圖3 miR-17-5p對PTEN表達的影響

2.4 PTEN表達上調對miR-17-5p過表達的MMQ細胞對CAB治療反應的影響 用miR-17-5p mimic和PTEN慢病毒載體共轉染MMQ細胞。采用Western blot法檢測轉染效率，結果提示，慢病毒轉染后PTEN基因蛋白表達量較對照組升高了249.6%。用CAB處理各組細胞，CCK-8法檢測細胞存活率，結果提示CAB+miR-17-5p mimic轉染組細胞相對活性為（74.8±1.9）%，CAB+miR-17-5p mimic+PTEN慢病毒載體共轉染組相對細胞活性為（57.0±1.8）%，較前降低23.8%，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。這些結果表明PTEN表達上調能部分逆轉miR-17-5p過表達引起的MMQ細胞對CAB的耐藥性。

3 討論

圖4 PTEN表達上調對miR-17-5p過表達MMQ細胞CAB耐藥性的影響

垂體泌乳素腺瘤是最常見功能性垂體腺瘤，常引起患者性腺機能減退和不育[1-2]。在治療垂體泌乳素腺瘤的一線藥物中，CAB能有效地減小腫瘤體積，抑制泌乳素分泌并能恢復性腺功能[3]。然而有一部分患者在治療過程中仍然表現出了對CAB的耐藥[1，5]，如何有效逆轉耐藥性是臨床治療上面臨的一個挑戰。miRNA是近年來發現的一類小分子非編碼單鏈RNA，在腫瘤發生發展進程中調控腫瘤相關基因的表達[16]，miRNA對多種腫瘤的發生發展都有影響，另有研究證實，miR-17-5p可以通過調控PTEN的表達影響胃癌的化療敏感性[17]。而我們既往的研究發現miR-17-5p在耐藥泌乳素瘤組織中表達顯著上升，但其具體作用及調控機制仍不明確[15]。有研究表明miR-17-5p能誘發結腸癌并促進其耐藥[14]，該過程主要通過抑制PTEN表達，激活PI3K/AKT信號通路來完成[18]。本項研究表明在垂體泌乳素腺瘤細胞中，miR-17-5p可能會通過下調PTEN的表達來促進腫瘤細胞的增殖并提高耐藥性。

PTEN基因定位于染色體10q23.3，由9個外顯子組成，編碼的蛋白質包含403個氨基酸，與腫瘤的發生發展具有密切關系[19]。PTEN蛋白可通過拮抗磷酸化酶的活性抑制腫瘤的生長[20-21]，對腫瘤細胞的生長、侵襲、遷移等方面有重要的作用[22]。近年來有關PTEN的研究逐漸增多，有研究表明骨肉瘤中的PTEN基因表達率明顯低于正常軟骨組織，提示骨肉瘤中的PTEN蛋白表達減少，從而失去了細胞周期的負調節，導致細胞異常增殖，最終引起腫瘤發生。由PTEN編碼的蛋白可以抑制骨肉瘤中的PI3K/AKT通路，抑制腫瘤的病理過程[23]。還有研究表明，miR-23a可以抑制骨肉瘤細胞中PTEN的表達從而促進其生長侵襲[24]。另外有研究表明，PTEN的表達異常對胃癌的發生發展起到重要的作用[25]。而我們的研究證實PTEN可能是miR-17-5p的直接作用靶標，在泌乳素瘤中，PTEN的上調可能會促進腫瘤對CAB的藥物敏感性。

綜上所述，本研究證實miR-17-5p能通過靶向調控PTEN基因的表達，從而促進MMQ細胞增殖，增強其對CAB的耐藥性，這為解決泌乳素腺瘤耐藥性提供了新的治療思路。相信隨著基因技術的發展，miR-17-5p可以作為評估泌乳素腺瘤耐藥性的重要分子生物標志物，并能將針對miR-17-5p的靶向治療應用于臨床。然而本研究尚有一些局限性。首先，miR-17-5p的效果及機制僅在大鼠細胞中進行了研究，在人類泌乳素瘤細胞尚未驗證。其次，除了提高MMQ細胞對CAB的耐藥性，miR-17-5p可能直接影響到細胞的增殖，因此，這些機制應該進行進一步的研究。