膽管細胞癌來源的外泌體通過內質網應激破壞血管內皮細胞緊密連接實現轉移

酈錚錚，孫洪偉，張楠，蘇華芳

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1.神經內科；2.肝膽外科；3.放化療科）

外泌體是一類由多種類型活細胞分泌的，直徑為30～100 nm的囊泡小體，含有許多生物活性物質，如蛋白質、mRNA、miRNA、DNA片段等[1-3]。這些生物活性物質可在細胞間相互傳遞，進而調節細胞的功能。近年來，外泌體在腫瘤微環境中的調控作用受到越來越多的關注。研究發現腫瘤細胞來源的外泌體能夠通過促進腫瘤血管新生[4]、誘導腫瘤相關成纖維細胞的分化[5]、參與腫瘤微環境中的免疫調控促進腫瘤的免疫逃逸[6]、塑造未來轉移靶器官的微環境以實現自身轉移[7]等多種方式，調控腫瘤微環境，進而促進腫瘤的進展。

腫瘤血管生成是腫瘤微環境的重要特征之一，在腫瘤的進展中發揮著關鍵作用。目前已有很多研究證實，外泌體能通過不同的途徑參與腫瘤血管的生成。如來源于人類白血病腫瘤細胞的外泌體傳遞的miRNA被臍靜脈內皮細胞攝取后，可導致腫瘤細胞遷移的增多和血管管腔的形成[8]。另外惡性黑色素瘤細胞來源的外泌體內含有miR-9，其被內皮細胞攝取后可以通過激活JAK-STAT通路來促進血管生成[9]。但有研究提示腫瘤在發展過程中在促進血管新生的同時，也伴隨著原有及新生血管的破壞。STRILIC等[10]發現腫瘤細胞通過激活內皮細胞表面的死亡受體6（death receptor 6，DR6）導致血管內皮細胞的凋亡從而發生遠處轉移，使用RIPK1抑制劑necrostatin-1，或特異性敲除小鼠內皮RIPK3明顯抑制腫瘤細胞的這種作用并使轉移發生率明顯下降。另外具有轉移能力的乳腺癌腫瘤外泌體中的miR-105特異性抑制血管內皮細胞間緊密連接蛋白ZO-1表達，進而摧毀血管內皮屏障來促進轉移前微環境的形成[11]。腫瘤外泌體是否通過其他的機制破壞血管完整性目前仍不得而知。本研究觀察膽管細胞癌來源外泌體對內皮細胞緊密連接蛋白，以及對體內血管通透性的影響，并進一步探討其可能的機制，為臨床防治腫瘤轉移提供新的依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 RPMI 1640培養基及高糖DMEM培養基購自美國Corning公司，ECM培養基購自美國ScienCell公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國Gibco公司，血清替代物購自美國Stembo公司；PKH26、70 kDa FITC標記的右旋糖酐購自美國Sigma公司；ZO-1（21773-1-AP，1∶1 000稀釋）、ATF6（66563-1-Ig，1∶1 000稀釋）抗體購自美國Proteintech公司，CD9（1∶1 000稀釋）、CLDN5（ab15106，1∶1 000稀釋）、eIF2α（ab169528，1∶1 000稀釋）、磷酸化eIF2α（ab32157，1∶1 000稀釋）抗體購自美國Abcam公司，PERK（5683，1∶1 000稀釋）、IRE-1α（3294，1∶1 000稀釋）購自美國CST公司，Alix（sc-49268，1∶1 000稀釋）、CD81（sc-7637，1∶1 000稀釋）、β-actin（sc-69879，1∶4 000稀釋）購自美國Santa Cruz公司；5×PrimerScript RT Master Mix，SYBR Green PCR試劑盒購自日本Takara公司。

1.2 外泌體分離和鑒定 人膽管細胞癌細胞系CCLP和人膽管上皮細胞系HIBEC接種于10 cm皿中，分別使用含10% Stembo血清替代物的RPMI 1640培養基及高糖DMEM培養基培養48 h后收集上清，300×g離心10 min，2 000×g離心10 min，10 000×g離心30 min去除所有的細胞及細胞碎片。隨后上清在10 kDa分子截流中空纖維膜濃縮管中以2 500×g濃縮10 min。上述上清于0.22 μm濾器過濾除菌后以110 000×g超速離心70 min，PBS洗滌1次并再次以110 000×g超速離心70 min。BCA法檢測蛋白濃度，Nanosight檢測外泌體粒徑分布，透射電鏡鑒定外泌體形態，蛋白電泳檢測Alix、CD9、CD81的表達。為檢測內皮細胞內吞外泌體，使用PKH26對外泌體進行染色，細胞內吞12 h后固定，鬼筆環肽細胞骨架染色并于激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝片。

1.3 臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）分離、分組及處理 收集2017年11月至2017年12月溫州醫科大學附屬第一醫院產科棄用的健康新生兒臍帶3例（已通過本院倫理委員會審查，所有產婦均充分知情并簽署知情同意書）。PBS沖洗殘留血液，1 mg/mL I型膠原酶37 ℃消化臍靜脈內腔30 min，隨后予含10% FBS的M199終止反應。收集消化液400×g離心5 min，PBS清洗1次并予含10% FBS的ECM重懸，接種于T25培養瓶中。24 h后更換全部培養基。所有實驗均使用第3～第6代HUVEC。HUVEC分為PBS、exoHIBEC及exoCCLP3組，分別使用PBS、5 μg/mL HIBEC外泌體（exoHIBEC）和5 μg/mL CCLP外泌體（exoCCLP）處理48 h并進行相關檢測。

1.4 內皮細胞層通透性檢測 HUVEC鋪被于0.4 μm孔徑transwell的上室中并充分生長至融合，同時予PBS、5 μg/mL exoHIBEC及5 μg/mL exoCCLP處理48 h。隨后于上室中加入10 mg/mL 70 kDa FITC標記的右旋糖酐，分別于10 min、30 min及60 min吸出下室中的培養基50 μL，并于多功能酶標儀中檢測OD值（488 nm激發波長，520 nm發射波長）。

1.5 免疫熒光 細胞鋪被于載玻片上予PBS、5 μg/mL exoHIBEC或5 μg/mL exoCCLP處理并生長至融合，予預冷丙酮固定10 min，PBS洗3次，5% BSA封閉15 min，一抗4 ℃孵育過夜（ZO-1，21773-1-AP，1∶100稀釋；CLDN5，ab15106，1∶100稀釋）。Alexa Fluor?488熒光二抗（1∶400稀釋）室溫避光孵育1 h，DAPI（1∶5 000稀釋）染核并予熒光抗淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并攝片。

1.6 Western blot檢測 經外泌體處理后的細胞予PBS洗1次，冰上RIPA裂解30 min。裂解液4 ℃12 000×g離心15 min收集上清。予BCA定量蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品上樣，SDS-PAGE電泳及轉膜。5%脫脂奶粉封閉1 h。一抗（稀釋度參照前述）4 ℃孵育過夜。PBST洗膜3次，二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育1 h，BioRad凝膠成像系統曝光。

1.7 實時定量PCR檢測 經外泌體處理后的細胞予TRIzol裂解提取總RNA，分光光度計檢測RNA濃度。取1 μg總RNA使用5×PrimerScript RT Master Mix反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，進一步使用SYBR Green PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR。引物序列參照表1，以GAPDH作為測定內參。

1.8 動物模型建立與處理 實驗選擇雄性BALB/c裸鼠（6～8周），實驗動物許可證號SCXK（蘇）2015-0001。實驗動物隨機分為PBS組、exoHIBEC組、exoCCLP組，上述動物每周3次尾靜脈注射PBS、20 μg exoHIBEC或20 μg exoCCLP。血管滲漏模型：上述裸鼠注射4周PBS或相應外泌體后予尾靜脈注射100 mg/kg 70 kDa FITC標記的右旋糖酐并在1 h后處死小鼠，收集裸鼠肝臟及肺組織，予OCT包埋并制作冰凍切片。熒光顯微鏡觀察肝臟及肺組織切片中的右旋糖酐滲出情況。腫瘤轉移模型：上述裸鼠注射1周PBS或外泌體后尾靜脈注射5×106CCLP細胞。此后繼續上述處理方式至4周。裸鼠處死后收集肺組織，予制作石蠟切片并予HE染色。光鏡下觀察并計數肺部轉移瘤數量。

1.9 統計學處理方法 采用GraphPad Prism 6.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用Dunnett’s檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 PCR引物序列

2 結果

2.1 CCLP外泌體的鑒定結果 應用經典的超速離心法從CCLP細胞上清中提取到的物質行粒徑分析，結果顯示其粒徑分布集中在170 nm左右（見圖1A）。電鏡結果提示具有典型的“杯口”樣形態（見圖1B）。Western blot結果提示獲得的沉淀表達CD9、CD81及Alix（見圖1C）。通過PKH26染色使外泌體膜成分著紅色熒光，并予HUVEC內吞12 h。激光共聚焦顯微鏡提示HUVEC能夠內吞外泌體（見圖1D）。以上結果表明通過超速離心法提取的物質的確為外泌體，并且外泌體能夠被HUVEC攝取。

圖1 外泌體鑒定和HUVEC對外泌體的內吞作用

2.2 CCLP外泌體破壞血管內皮細胞的緊密連接與PBS組比，exoCCLP明顯抑制HUVEC緊密連接蛋白ZO-1及CLDN5的表達（P＜0.05）（見圖2A-B）。免疫熒光提示經exoCCLP處理后的HUVEC其ZO-1失去完整性，在細胞連接處呈現點狀分布，而CLDN5在內皮細胞中僅呈片狀表達。PBS及exoHIBEC不影響HUVEC ZO-1及CLDN5表達（見圖2C）。內皮細胞通透性實驗提示經exoCCLP作用后，上室中FITC標記的右旋糖酐滲漏入下室較PBS及exoHIBEC處理組明顯增多（P＜0.05）（見圖2D-E），提示exoCCLP使HUVEC單細胞層的通透性明顯增加。以上結果表明CCLP來源的外泌體能夠抑制內皮細胞緊密連接蛋白的表達，增加血管的通透性。

2.3 CCLP外泌體在體內增加血管通透性 與PBS及exoHIBEC相比，尾靜脈注射exoCCLP4周后明顯增加裸鼠肺部（見圖3A）及肝臟（見圖3B）內的FITC-右旋糖酐的滲出。另外在持續接受PBS、exoHIBEC、exoCCLP尾靜脈注射的裸鼠中注射CCLP細胞，肺組織切片HE染色提示exoCCLP處理組腫瘤灶數量明顯增多（見圖3C）。以上結果表明CCLP在體內能夠增加血管的通透性并促進腫瘤的轉移。

2.4 CCLP外泌體引起血管內皮細胞內質網應激導致內皮細胞緊密連接蛋白下降 HUVEC經exoCCLP作用不同時間段后Western blot及PCR檢測內質網應激相關指標。與PBS及exoHIBEC相比，exoCCLP提高HUVEC內質網應激相關基因如XBP1、ATF6、PPP1R15A等（見圖4A），增加內質網應激相關蛋白如IRE1α、ATF4的表達，并促進PERK及其下游eIF2α的磷酸化（見圖4B）。通過小干擾RNA分別下調HUVEC ATF6、IRE1α或PERK后再加入exoCCLP作用48 h，Western blot檢測緊密連接蛋白。結果提示PERK及IRE1α敲減能夠改善exoCCLP對內皮細胞緊密連接蛋白的下調作用（見圖4C）。這些結果表明CCLP來源的外泌體能夠通過引起內皮細胞發生內質網應激導致緊密連接蛋白下調。

圖2 CCLP外泌體體外破壞血管內皮細胞層緊密連接并增加其通透性

3 討論

腫瘤血管生成是腫瘤微環境一個重要的特征，在腫瘤的進展中發揮著關鍵作用。目前已有很多研究證實，外泌體能通過不同的途徑參與腫瘤血管的生成[12-14]。但最近的研究顯示腫瘤在發展過程中在促進血管新生的同時，也伴隨著原有及新生血管的破壞[10-11，15-16]。緊密連接蛋白直接調控著內皮細胞與上皮細胞的通透性。而脫落的腫瘤發生轉移的重要一步就是與內皮層相互作用并穿透內皮屏障[17]。因此緊密連接蛋白成為腫瘤發生轉移前必須攻克的第一道屏障。我們的研究結果表明膽管細胞癌來源的外泌體能夠下調內皮細胞ZO-1、CLDN5的蛋白水平。因此證明該腫瘤來源的外泌體能夠破壞血管屏障功能，增加血管的通透性。

圖3 CCLP外泌體在體內增加血管通透性并促進腫瘤轉移

未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）信號通路由3種定位于內質網上的跨膜蛋白IRE1、PERK和ATF6所始動[18]。通常情況下這3種內質網應激的感受器通過與免疫球蛋白重鏈結合蛋白（BiP/GRP78）結合而處于非激活狀態。當內質網腔內的未折疊蛋白堆積時，BiP脫落并進一步活化未折疊蛋白信號通路。這種適應性的細胞反應通過磷酸化eIF2α下調細胞蛋白合成水平，并通過轉錄活化XBP-1及ATF6增強內質網的蛋白折疊能力及異常折疊蛋白降解能力，恢復細胞內蛋白折疊的穩態[19-21]。我們的實驗觀察到HUVEC經exoCCLP處理后PERK、eIF2α磷酸化增強，總IRE1α、ATF4表達增加，其下游拼接型態XBP1 mRNA水平增加，我們也觀察到多種內質網相關的基因如DDIT3、PPP1R15A增加，提示exoCCLP引起HUVEC的內質網應激反應。

內質網應激增加PERK激酶的活性，引起eIF2α磷酸化，從而導致翻譯停滯及活化下游信號通路，引起全面性細胞蛋白合成和增殖停滯[22]。在本研究中我們發現內皮細胞的緊密連接蛋白ZO-1及CLDN5明顯下調。通過小干擾RNA敲減HUVEC的ATF6、PERK或者IRE1α水平，我們發現HUVEC細胞PERK或者IRE1α水平下調能夠逆轉exoCCLP引起的緊密連接蛋白表達抑制，而敲減ATF6并無此作用。上述結果提示：①exoCCLP通過內質網應激引起內皮細胞緊密連接蛋白下調；②在內質網應激3條通路中，exoCCLP主要通過PERK和IRE1α通路引起緊密連接蛋白下調。

最新的研究發現，在胰腺癌中存在持續內質網應激反應，但缺乏IRE1α的激活并缺乏其下游拼接型XBP1，導致胰腺癌細胞的免疫抵抗及轉移[23]。因此其他腫瘤細胞中無法緩解的內質網應激可能是普遍存在的。我們推測未折疊蛋白在腫瘤細胞內堆積，無法通過未折疊蛋白反應清除，因此可能經過外泌體包裝被分泌到周邊細胞中，引起周邊正常細胞的內質網應激反應。另外，研究顯示哺乳動物細胞中存在另一種非常規的內質網應激激活方式：細胞內異常飽和度的脂質雙分子層能夠通過激活PERK及IRE1α的跨膜段而非內質網腔內段引起內質網應激[24]。而外泌體是一類由脂質雙分子層包裹的囊泡小體，在腫瘤包裝和分泌的過程中可能破壞其脂質飽和度，引起受體細胞的PERK及IRE1α的跨膜段激活而誘發內質網應激。但上述推測需要研究進一步證實。

圖4 CCLP外泌體激活內皮細胞內質網應激通路

綜上所述，膽管細胞癌來源的外泌體能夠通過引起內皮細胞內質網應激抑制緊密連接蛋白表達，破壞血管內皮屏障的完整性從而利于轉移的發生。