枯草桿菌芽孢皮層裂解酶CwlJ的重組表達(dá)及分離純化

馬慧嬌，郭洪偉，曾朝瑋，郭家俊，章 中

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

【研究意義】細(xì)菌芽孢易致食品腐敗和食品安全問題，且難以被各種殺菌處理殺滅。在芽孢萌發(fā)而轉(zhuǎn)變成營養(yǎng)體的過程中，皮層裂解酶會被激活，進(jìn)而將芽孢皮層肽聚糖水解，導(dǎo)致芽孢核心的水化而失去極端抗性，這是造成芽孢死亡的重要原因，因此將皮層裂解酶分離純化出來就顯得尤為重要[1-4]。【前人研究進(jìn)展】芽孢的極端抗性是與其特有結(jié)構(gòu)息息相關(guān)的，其從外到里有7層結(jié)構(gòu)，分別是孢外壁、芽孢衣、外膜、皮層、細(xì)胞壁、內(nèi)膜、核心[5]。芽孢皮層主要由肽聚糖構(gòu)成，是維持芽孢休眠狀態(tài)和極端抗性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。皮層裂解酶是芽孢所特有的專一水解皮層肽聚糖的酶，枯草芽孢桿菌基因組中有許多皮層裂解酶同系物的存在，最常見的就是CwlJ(Cell wall hydrolase CwlJ)[6-7]。CwlJ位于孢外層，在母細(xì)胞中合成，休眠態(tài)芽孢中，CwlJ不能獨(dú)立定位，仍需外衣蛋白YwdL的輔助，其屬何型酶及具體功能還有待實(shí)驗(yàn)證實(shí)[8-9]。【本研究切入點(diǎn)】從天然菌種中提取皮層裂解酶，工作量大、難以分離純化且產(chǎn)率還低，所以本文通過基因工程操作技術(shù)，構(gòu)建了皮層裂解酶CwlJ的基因工程菌，以獲得大量的皮層裂解酶。【擬解決的關(guān)鍵問題】獲得大量的皮層裂解酶CwlJ，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)材料，為推動CwlJ水解肽聚糖進(jìn)而殺滅芽孢并應(yīng)用于食品殺菌奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑 Protein Marker：Thermo公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、Tris：購自Sigma 公司；SDS：Amresco公司；TEMED：BIO-RAD公司；胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)：OXOID 公司；……