（長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022）

自1996年轉(zhuǎn)基因作物在美國首次商業(yè)化大規(guī)模種植以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域得到了快速的應(yīng)用與發(fā)展，并且隨著其種植面積的不斷擴大，已經(jīng)對現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)方式產(chǎn)生了巨大而深刻的影響。根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）于2018年6月發(fā)布的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2017年種植轉(zhuǎn)基因作物的國家已經(jīng)達到24個，并且全世界轉(zhuǎn)基因作物種植面積由1996年的174萬公頃增加到2017年的1.898億公頃，增長種植面積超過了110倍［1］。隨著轉(zhuǎn)基因作物的迅猛發(fā)展，關(guān)于轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品成分食用和環(huán)境安全性的爭議也與日俱增，世界各國都在不同程度上制訂了相應(yīng)的管理制度，主要包括轉(zhuǎn)基因的安全性評價制度和轉(zhuǎn)基因成分標識制度等［2-4］。目前，國內(nèi)外對轉(zhuǎn)基因作物及其相關(guān)制品的檢測主要是針對其含有的外源蛋白和外源核酸展開的，并且已經(jīng)建立了一系列轉(zhuǎn)基因定性和定量檢測技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）、PCR技術(shù)、等溫擴增技術(shù)（LAMP）、基因芯片技術(shù)（gene chip）及數(shù)字PCR技術(shù)（digital PCR）等［5-6］。

我國對待轉(zhuǎn)基因采取比較謹慎的態(tài)度，于2001年相繼頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》及一系列管理辦法，對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品實行安全評價、產(chǎn)品標識、生產(chǎn)許可、經(jīng)營許可、進口許可、加工許可等方面管理［7-8］。目前我國實施的是沒有閾值的標識制度，規(guī)定來源于玉米、大豆、番茄等五種作物的17種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品必須進行標識［9-12］。然而市場上一些散裝售賣的農(nóng)作物加工品普遍存在缺乏明顯標識的現(xiàn)象，且深加工制品一般核酸會受到不同程度的破壞，不便于檢測與監(jiān)管［13］。

本文參照國家標準中提供的植物基因組提取方法，通過對試劑盒法、胍-氯仿法和CTAB法提取食品中基因組DNA效果進行比較，選擇出DNA回收率高、純度高的方法用于后續(xù)的PCR檢測，然后針對轉(zhuǎn)基因食品中一些常見的外源基因及調(diào)控元件設(shè)計出特異性引物，構(gòu)建普通PCR的檢測方法，并且擴增片段都小于200bp以適用于深加工品的檢測，為監(jiān)管部門對轉(zhuǎn)基因食品標識的監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 實驗材料

1.1 實驗樣品

非轉(zhuǎn)基因玉米種子黏墾、非轉(zhuǎn)基因大豆種子合豐、陽性質(zhì)粒pUC57-TP（見圖1）為本實驗室保存，轉(zhuǎn)基因玉米MON89034、MIR162，轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2（5%），陽性質(zhì)粒pBJGMM001（見圖2）均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供［14］，豆?jié){粉、豆芽購自超市。

圖1 pUC57-TP質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

圖2 pBJGMM001質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

1.2 實驗藥品

PCR反應(yīng)試劑（上海生工生物工程股份有限公司），EDTA、異丙醇、NaOH（天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司），NaCl、無水乙醇、氯仿、異戊醇（北京化工廠），PVP40000（寶泰克生物科技公司），Proteinase K（Genview），Tris（BioFroxx），CTAB（上海源葉生物），β-巰基乙醇、Tris飽和酚（北京鼎國生物）、質(zhì)粒提取試劑盒（北京天根生物科技公司）、植物基因組提取試劑盒（艾德萊生物）。

1.3 實驗儀器

PCR儀（LifeTouch公司），離心機（Eppendorf公司），電泳槽，電泳儀，凝膠成像儀Azure c300（azure biosystems公司），微量核酸測定儀Nanodrop One（美國Thermo Fisher公司）。

2 實驗方法

2.1 基因組DNA提取

參照GB/T 19495.3-2004中基因組DNA的CTAB提取方法［15］、胍-氯仿法，及購買的植物基因組提取試劑盒分別對豆芽、豆?jié){粉、大豆種子的基因組進行提取，每種方法設(shè)置兩組重復(fù)。將DNA沉淀用去離子水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

通過凝膠電泳實驗判斷所提取植物及其加工品基因組DNA的完整度，再用微量核酸及蛋白測定儀Nanodrop One對提取DNA的濃度和純度進行測定分析。

2.2 陽性質(zhì)粒分子的提取

從-80℃冰箱中取出凍存的菌株，將其按1∶100接種到氨芐青霉素終濃度為100μg/mL的5mL LB培養(yǎng)基中，在37℃下180rpm振蕩過夜，再將菌液在4℃下離心分離，使用天根Mini Plasmid Kit提取大腸桿菌中的質(zhì)粒，操作步驟參照試劑盒的說明書。

將質(zhì)粒溶液保存在1.5mL離心管中，通過凝膠電泳實驗判斷質(zhì)粒DNA的提取情況。

2.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)CaMV35S啟動子、NOS終止子、CaMV35S終止子、NOS啟動子、FMV35S啟動子、Hpt、CP4-EPSPS、Cry1A.105、Cry2Ab2九種不同基因的核苷酸序列，使用Oligo 7.0設(shè)計出特異性引物，玉米內(nèi)參zSSIIb、大豆內(nèi)參Lectin的引物序列參照國家標準GB/T19495.4-2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定性PCR檢測方法》［16］，引物的詳細信息見表1，并由長春庫美生物公司合成和純化，用去離子水稀釋成100μM備用。

2.4 PCR反應(yīng)體系及條件

PCR反應(yīng)體系見表2，PCR反應(yīng)條件見表3。

表1 引物序列

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 PCR反應(yīng)條件

2.5 電泳檢測

吸取PCR產(chǎn)物10μL，在2%瓊脂糖凝膠中電泳，緩沖液為0.5×TBE電泳緩沖液，設(shè)置水空白對照、陰性對照、陽性對照，以DL2000 DNA Marker作為標準尺，在100V電壓下電泳30min，通過EB染色［17-18］，在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

3 實驗結(jié)果

3.1 不同基因組提取方法比較

分別用植物基因組試劑盒法、CTAB法和鹽酸胍-三氯甲烷法對豆芽、豆?jié){粉、大豆種子中的基因組DNA進行提取，從電泳結(jié)果和核酸含量測定中可以看出，相同質(zhì)量的樣品用CTAB法提取到的基因組DNA的含量和純度最高，后續(xù)實驗將采用CTAB法提取食品中DNA進行PCR檢測驗證。

圖3 三種不同方法對不同樣品基因組提取結(jié)果

表4 不同方法提取核酸含量測定結(jié)果

3.2 陽性質(zhì)粒提取

從圖4、圖5電泳結(jié)果可以看出，所提取的陽性質(zhì)粒條帶明亮清晰，可適用于后續(xù)的PCR檢測。

圖4 pUC57-TP質(zhì)粒提取結(jié)果

圖5 pBJGMM001質(zhì)粒提取結(jié)果

3.3 PCR檢測方法特異性驗證

以空白對照（水）、陰性樣本、陽性樣本（或陽性質(zhì)粒）作為實驗材料，分別對9種基因的PCR檢測方法進行特異性驗證，結(jié)果如圖6所示。從中可以看出9種基因的檢測方法均能從陽性樣本（或陽性質(zhì)粒）中得到預(yù)期大小一致的擴增產(chǎn)物，而在陰性樣本、空白對照及不含目標基因的轉(zhuǎn)基因樣本中均未出現(xiàn)擴增（部分有引物二聚體出現(xiàn)），說明該檢測方法具備高度特異性。

圖7 不同基因PCR檢測方法的靈敏度

圖6 PCR檢測方法特異性結(jié)果

3.4 PCR擴增產(chǎn)物的測序驗證

將PCR擴增得到的9種擴增產(chǎn)物送去生工公司測序，測序結(jié)果與已知的目標基因序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)9種PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果與已知序列基本一致，驗證了擴增產(chǎn)物的正確性。

3.5 PCR檢測方法的靈敏度試驗

將提取的基因組DNA稀釋至200ng/μL，那么50ng/反應(yīng)，因為玉米基因組大小為2500Mbp，所以約18242 copies/反應(yīng)，pBJGMM001質(zhì)粒與pUC57-TP質(zhì)粒大小分別為5078bp、3169bp，200ng/μL玉米基因組拷貝數(shù)分別等同于質(zhì)粒40.623×10-5ng/μL、25.351×10-5ng/μL，然后將陽性質(zhì)粒與陰性玉米混合成不同的百分含量，同時也將MON89034、GTS40-3-2、MIR162與非轉(zhuǎn)基因樣品按質(zhì)量比進行混合，制備成5%、1%、0.5%、0.1%的梯度，進行靈敏度測試。從圖7結(jié)果中可以看出，p35S、tNOS、Hpt、t35S、pNOS、pFMV35S、Cry2Ab2的PCR檢測方法均可從含量0.1%的樣品中擴增出與預(yù)期大小一致的PCR產(chǎn)物，而CP4-EPSPS、Cry1A.105能從含量0.5%的樣品中得到擴增（詳細信息見表5），能夠滿足對食品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測。其中，MIR162中由于含有的t35S片段太短與引物序列不一致，所以并未得到擴增。

表5 9種檢測方法檢測限與適用性

4 結(jié)論

本研究通過對CTAB法、胍-氯仿法和試劑盒法三種植物基因組提取方法進行比較，篩選出提取率最大、提取純度最高的CTAB法用于本實驗樣品基因組的提取。以Lectin基因、zSSIIb基因分別為大豆、玉米的內(nèi)標準基因，針對轉(zhuǎn)基因作物中9種常見的外源基因序列為模板，設(shè)計出9對引物，建立了定性PCR的檢測方法，該方法具有高度的特異性，檢測靈敏度可達0.1%～0.5%，滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測要求。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進一步發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物的種類也在不斷增加，據(jù)ISAAA于2018年發(fā)布的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)基因玉米單品系現(xiàn)有44種，轉(zhuǎn)基因大豆單品系現(xiàn)有25種。目前，國家發(fā)布的相關(guān)標準文件中公布了18種篩選檢測基因、15種大豆品系、23種玉米品系PCR檢測方法的推薦標準，本文就其中p35S、tNOS、Hpt、t35S、pNOS、pFMV35S、CP4-EPSPS、Cry1A.105、Cry2Ab2九種基因構(gòu)建了定性PCR檢測方法，后期將進一步增加篩選檢測和品系檢測的覆蓋范圍，并開發(fā)出定量檢測的熒光PCR和數(shù)字PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因，為我國的轉(zhuǎn)基因監(jiān)管提供依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。