海洋源蛋白酶產生菌篩選及酶學特性的初步研究

曹 紅，王秀娟，翁佩芳*，周小敏，高志中，吳祖芳，張 鑫

（1.寧波大學 海洋學院，應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211；2.浙江興業集團有限公司，浙江 舟山 316100）

傳統的魚醬油是自然溫度下通過耐鹽微生物和魚體自身所含的酶對原料魚中的蛋白質、脂肪等成分進行發酵分解，形成氣味濃郁、滋味獨特、營養豐富的發酵液[1-2]，包括其中的微生物產生的蛋白酶降解蛋白質形成多肽、氨基酸等風味物質[3-4]。但是傳統的魚醬油生產鹽度過高，生產周期長達數月乃至數年，產量難以提高；另一方面，自然發酵過程中菌群復雜，特征風味物質不穩定，進行速釀工藝研究是魚醬油產業發展的必然要求[5]。目前速釀工藝主要依靠超高壓水解、外加酶發酵、外加曲發酵和加酸減鹽等快速發酵方法[6]，但是這些方法均存在一定的局限性，如超高壓水解法操作要求較高，不容易達到產業化規模[7]；外加酶發酵會產生苦味膚，影響風味[8]；外加曲發酵需要在發酵初期加足鹽量，防止魚體腐爛，但由過高的鹽濃度抑制了種曲與魚體內臟酶活力，生產周期沒有明顯縮短[9]；加酸減鹽發酵雖可促進魚肉的自溶并縮短發酵時間，但是所得魚露口感偏酸，不符合人們的飲食習慣[10]。

近幾年國內外研究者對魚醬油發酵過程中微生物分解蛋白質對產品影響機理的研究[11-12]，進一步證明利用產蛋白酶微生物菌株作為發酵劑可改善產品品質和縮短發酵周期。文獻 [11]將T.halophilus接種至魚肉湯中，發現其風味物質、氨基酸等營養物質與自然發酵魚醬油中的基本一致。文獻[5，13]均發現將嗜鹽古生菌接種到魚露發酵中，不僅縮短魚露發酵周期，并且達到了去腥、防腐的效果，避免不良風味的產生。因此外加產蛋白酶微生物法，為魚露的速釀工藝及產品品質改善提供了一種新的解決途徑。

本課題組在前期分析了魷魚魚醬油自然發酵過程中的微生物多樣性及幾種魚醬油的品質比較分析，期望從海洋源的原料中直接篩選出產蛋白酶微生物應用于魚醬油發酵生產。魚醬油的原料主要為海洋低值魚類，其體內本身就存在大量產蛋白酶微生物，可以直接從其體內篩選。魷魚及其副產物常作為魚醬油發酵的原料，且魷魚蛋白質含量高，體內菌群分布廣泛，其優勢菌群為假單胞菌、芽孢桿菌等產蛋白酶的微生物[14]。但針對應用魚醬油發酵的產蛋白酶微生物的研究較少，本文通過從海洋源魷魚分離篩選出高產蛋白酶菌株，旨在為魚醬油的速釀工藝及品質改善提供微生物來源。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

材料：從寧波路林市場采購新鮮的魷魚，4℃保存備用。

試劑：福林酚試劑（國藥集團化學試劑有限公司）；L-酪氨酸 （國藥集團化學試劑有限公司）；E.Z.N.A.TM Bacterial DNA Kit（大連寶生物工程有限公司）。

培養基：脂牛奶固體培養基（g/L）：脫脂奶粉75 g，105℃下滅菌 15 min，瓊脂15 g，121℃下滅菌15 min，將兩者在無菌環境下混合；干酪素固體培養基（g/L）：A 液：Na2HPO4·12H2O 1.07 g，干酪素 4 g，200 mL水溶解，70℃下水浴 2 h；B 液：KH2PO43 g，200 mL水溶解；A、B液混合后加入瓊脂15 g，定容至1 000 mL，121℃下滅菌15 min；液體發酵培養基（g/L）：蛋白胨 10 g，牛肉膏 3 g，氯化鈉 5 g，121 ℃下滅菌 15 min；斜面保藏培養（g/L）：蛋白胨 10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，121℃下滅菌15 min。

1.2 儀器

QYC-2102C恒溫振蕩培養箱 （寧波江南儀器廠）；HWS智能型恒溫培養箱 （寧波江南儀器廠）；LV-3300分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；5804R高速冷凍離心機 （德國Eppendorf公司）；5814R小型高速離心機 （德國Eppendorf公司）；5331 PCR儀（德國Eppendorf公司）；Gel Doc XR 凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預處理將新鮮的魷魚采用無菌操作分離魚皮、內臟，并用整魚作對照，用滅菌的組織絞碎機絞碎后，用無菌生理鹽水浸泡沖洗并收集洗液到無菌離心管中，此為樣品原液。

1.3.2 高產蛋白酶菌株的初篩取1 mL樣品原液制備成10-1、10-2和10-33個梯度菌懸液，分別取200 μL菌懸液涂布于脫脂牛奶固體培養基上，每個梯度設3個平行，于30℃恒溫培養箱培養3 d，選取菌落周圍具有明顯透明圈的菌株，于脫脂牛奶固體培養基上進行劃線純培養。

將上述純化的菌株用接種環點種在干酪素固體培養基上，每株菌株設3個平行，于30℃恒溫下培養3 d，挑選能夠產生較大透明圈的菌株，并記錄其透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），比較D/d值，選擇D/d＞2的菌株進行復篩。

1.3.3 高產蛋白酶菌株的復篩挑取初篩得到的菌株，接種到50 mL基礎發酵培養基中，置于恒溫搖床中，30℃、150 r/min活化24 h，作為種子液，再以4%接種量，接種到發酵培養基中，30℃、150 r/min 培養 3 d，取發酵液，離心（6 000 r/min，15 min，4℃）收集上清液，上清液即為粗酶液，測定粗酶液蛋白酶活力。篩選出酶活力較高的菌株即為代表菌株，其中酶活力最高菌株即為目的菌株。

1.4 蛋白酶活力的測定

采用福林酚法（GB/T 23527—2009）測定蛋白酶活力。

1.5 代表菌株的鑒定

1.5.1 目的菌株形態及生理生化鑒定菌落形態觀察：將目的菌株劃線接種于牛肉膏-蛋白胨培養基，30℃培養培養2 d，觀察菌落形態特征和革蘭氏染色特征。

生理生化試驗：參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》，對目的菌株進行糖發酵試驗、V-P試驗、甲基紅試驗等生理生化試驗。

1.5.2 代表菌株16S rRNA鑒定使用細菌DNA試劑盒E.Z.N.A.TM Bacterial DNA Kit提取分離純化出的代表菌株DNA，以提取出的細菌DNA為模板，采用通用引物序列 27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 和 1492R （5'-TACGGCTA CCTTGTTACGACTT-3'）擴增菌株的16S rRNA基因[15]。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）反應體系包括：上下游引物（10 umol/L）各 2 μL，模板 DNA 2 μL，Taq 酶 25 μL，無菌去離子水補充至50 μL。PCR擴增條件為：（1）95℃預變性 3 min；（2）94 ℃變性 50 s，52 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 90 s，30個循環；（3）72 ℃延伸 10 min。

1.5.3 16S rRNA基因序列分析及系統發育分析將經電泳檢測擴增良好的PCR產物，送往上海桑尼生物科技有限公司進行測序，測序所用引物與PCR擴增引物相同。測序所得序列使用BLAST程序，通過美國國家生物信息中心（NCBI）的GenBank數據庫進行同源性比較分析。依據序列分析結果，選擇與目的菌株序列相似性較高（99%以上）的已知菌株序列，利用MEGA5.05[16]軟件構建系統發育樹。

1.6 粗蛋白酶特性研究

1.6.1 pH對粗蛋白酶活的影響分別配制pH為3.0～11.0的梯度緩沖溶液，以1%酪蛋白溶液作為粗酶活測定的反應底物，以最高點的粗蛋白酶活力為100%，其他與之相比得相對酶活力，繪制粗蛋白酶的最適pH值曲線。

1.6.2 pH穩定性研究將粗蛋白酶液分別與不同pH的緩沖溶液混合均勻，置于40℃下水浴保溫1 h后，測定剩余酶活，以最高點粗蛋白酶活力為100%，其他pH條件下與之相比為相對酶活，繪制粗蛋白酶的pH值穩定性曲線，計算相對酶活力。

1.6.3 溫度對粗蛋白酶活的影響在溫度分別為4、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃下 測 定 該菌株粗蛋白酶液酶活，其他條件不變，以最高點粗蛋白酶活力為100%，其他與之相比得相對酶活，以確定粗蛋白酶的最適反應溫度，繪制酶催化溫度曲線，計算相對酶活力。

1.6.4 熱穩定性研究在35、40、45℃不同溫度條件下，將粗蛋白酶液置分別保溫一定時間，取出后迅速冷卻，以pH 7.2的1%酪蛋白溶液為反應底物，40℃下測定剩余粗蛋白酶活力，以未處理的粗蛋白酶液的酶活為100%，其他溫度條件下與之相比為相對酶活，繪制酶熱穩定性曲線，計算相對酶活力。

1.6.5 金屬離子對酶活的影響向反應體系中加入終濃度為 1 mmol/L不同金屬離子：Ca2+、Mg2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Ba2+、Mn2+，充分混勻后，在 40 ℃下放置24 h，測定酶活，以超純水為空白對照的粗蛋白酶液的酶活力為100%，其他金屬離子下與之相比為相對酶活，計算相對酶活力。

2 結果與分析

2.1 高產蛋白酶菌株的篩選

2.1.1 高產蛋白酶菌株的初篩從脫脂牛奶平板培養基上挑取具有明顯透明圈的菌株，接種在干酪素平板分離培養上，篩選透明圈D/d＞2的菌株，透明圈結果如圖1所示。分別從魷魚魚皮、內臟、整魚（分別記為SE、SV、SW，下同）中分離得到5株、4株、7株產蛋白酶菌株。由此看出，產蛋白酶菌株在魷魚不同部位的數量無明顯差異，這表明在魷魚體內產蛋白酶菌株分布較均勻。一般來講，新鮮捕獲的健康魷魚其組織內部是無菌的，然而在魚表面的黏液及內臟內存在微生物，這主要是魷魚蛋白質含量豐富利于微生物的寄生[17]。

圖1 產蛋白酶菌株在脫脂牛奶平板培養基Fig.1 Transparent circles on skim-milk culture

2.1.2 高產蛋白酶菌株的復篩將上述初篩得到的16株產蛋白酶菌株發酵培養，測定發酵液的蛋白酶活力。酪氨酸標準曲線公式：y=0.010 3x-0.006 8（R2=0.999 7，0＜x＜100 ug/mL），根據酶活力公式計算各菌株產酶能力。復篩結果如表1所示，由表1可以看出SW5產酶活性最高為257.67±2.44 U/mL，對比文獻[18]從南海深海海泥中篩選出的產蛋白酶菌株蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）酶活力為90 U/mL提高近3倍，并將SW5菌株作為目的菌株，進一步做產酶特性研究，將表1中所有菌株作為代表菌株，進行菌株鑒定。

2.2 代表菌株鑒定

將上述復篩得到的10株菌株，革蘭氏染色觀察。以細菌通用引物27F和1492R對代表菌株進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，均得到重復性好且穩定、清晰的特異性條帶，片段大小為1200 bp左右，電泳圖譜如圖2所示。再將測序后的序列在NCBI數據庫進行比對，所得結果如表2所示。結果表明篩選出的菌株可以分為3類：芽孢桿菌屬（Bacillussp.）、普羅威登斯菌屬（Providenciasp.）、假單胞菌屬 （Pseudomonassp.），且置信度≥98%，其中解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）較多。目的菌株SW5為甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus），置信度為 100%。研究發現魷魚中產蛋白酶的微生物主要為芽孢桿菌屬和假單胞菌屬[19-20]。芽孢桿菌產生蛋白酶能力較強，是常見的商業產蛋白酶菌株，有學者對芽孢桿菌所產的蛋白酶學性質進行了研究，發現此類菌具有較高的酶活力，可能是通過產生蛋白酶降解蛋白質[21]。魷魚中的優勢菌群主要為假單胞菌，假單胞菌大多耐低溫，分泌的蛋白酶卻耐高溫，即使經過高溫處理后，在食品中仍然能檢測到這種酶的存在，在低溫儲藏條件下，殘留的蛋白酶也可以繼續分解蛋白質[22]。國內對普羅威登斯菌的報道較少，一般在肉類食品中容易檢測到，是動物腸道的正常菌群，同樣對蛋白質具有分解作用[23]。

表1 產蛋白酶菌株復篩結果Table 1 Results of the screening protease producing strain

圖2 菌株DNA的PCR擴增產物電泳圖譜Fig.2 Electrophoregram of PCR amplification products of strains'DNA

表2 代表菌株鑒定結果Table 2 Identification results of the representative strains

2.3 目的菌株SW5鑒定及其系統發育樹建立

菌株SW5革蘭氏染色為陽性，芽孢染色陽性，生理生化試驗結果見表3。根據 《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》中芽孢桿菌屬的特征描述，可以確定菌株SW5屬于芽孢桿菌屬。將SW5的16S rRNA序列提交NCBI，在Genbank數據庫中進行同源性比較分析，選取同源性在99%以上的菌株的序列，用Mega5.05軟件進行序列對比，建立的系統發育樹如圖3所示。從圖3可以看出，SW5菌株與甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicusKC790303.1）同源性最高，可達100%。由此可以推斷出高產蛋白酶菌株SW5為甲基營養型芽孢桿菌。研究報道甲基營養型芽孢桿菌對外界有害因子抵抗力強、分布廣，存在于土壤、水、及動物腸道等處[24]。張巖等從合浦珠母貝黏液中同樣分離得到一株甲基營養型芽孢桿菌，經研究發現其蛋白酶的酶解發酵液具有抑菌作用，可作為天然防腐劑的開發，其抑菌成分為蛋白或多肽類物質[25]。楊佳等從肖爾布拉克酒業醬香型高溫大曲中分離得到的甲基營養型芽孢桿菌不僅產蛋白酶活力高，而且能夠發酵產生香氣物質，調節食品風味[26]。

2.4 粗蛋白酶特性分析

2.4.1 粗蛋白酶的最適pH及其酸堿穩定性測定不同pH對粗蛋白酶活性的影響，結果如圖4所示，pH在3～8時，SW5菌株所產粗蛋白酶的酶活力隨pH增加逐漸升高，pH為8.0時，粗酶活力達到最高，若繼續pH升高，則粗酶活力逐漸下降，由此看出該菌株所產蛋白酶的最適pH為6.0～8.0。黃紫燕研究發現魚醬油發酵過程中的優勢乳酸菌所產蛋白酶的最適pH為7.0，本實驗結果與其報道一致，發酵液的pH與魚露的各項理化指標及風味密切相關[27]。蛋白酶在魚醬油發酵過程中的主要作用是不斷把魚肉蛋白分解成小分子的肽或游離氨基酸，進而影響發酵液pH及風味[28]。

表3 SW5菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of SW5

圖3 菌株SW5的16S rRNA基因序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain SW5

SW5菌株所產粗蛋白酶對pH的穩定性如圖5所示，pH為8.0～10.0時，該粗蛋白酶的穩定性較好，均已達到85%以上；但當反應體系為酸性條件時，粗酶活力損失比較嚴重，因此可以判斷該菌株所產粗蛋白酶在堿性條件下能夠發揮其優勢作用。

2.4.2 粗蛋白酶的最適溫度及其熱穩定性測定SW5菌株所產粗蛋白酶在不同溫度條件下的酶活性，結果如圖6所示，由圖可知當溫度較低時，粗蛋白酶活力隨溫度的升高而逐漸增大，當溫度升高到40℃時，該粗蛋白酶活力達到了最高，在30～50℃時具有較高酶活性。當溫度低于30℃或高于50℃時，粗蛋白酶活力均會顯著下降。國內外研究發現魚醬油發酵的溫度一般在30～45℃[29]，張豪等研究了魚醬油曲的制備工藝，當發酵溫度為37℃時得到的魚醬油具有固有香型，達到了速釀的目的[30]。因此，該菌株所產的蛋白酶可以作為外源酶添加到魚醬油發酵中，為魚醬油發酵提供一種新的參考。

圖4 pH對粗蛋白酶活性的影響Fig.4 Effect of pH on crude protease activity

圖5 pH穩定性Fig.5 pH stability

SW5菌株所產粗蛋白酶對溫度的穩定性如圖7所示，若保溫相同時間，隨溫度的升高，粗蛋白酶活性逐漸降低；在35℃下，保溫不同時間測定粗蛋白酶活性，保溫60 min后仍保留80%以上的酶活性，相對穩定；當溫度為55℃時，保溫30 min后粗蛋白酶活力損失了25%，保溫60 min后，粗蛋白酶活力僅剩余60%。由此可知，該蛋白酶在35℃擁有良好的穩定性。

2.4.3 金屬離子對粗蛋白酶活力的影響測定不同金屬離子對SW5菌株所產粗蛋白酶活性的影響，金屬離子濃度均設為1 mmol/L，實驗結果如圖8所示，Mn2+、Ba2+和Ca2+對該菌株所產粗蛋白酶的酶活力均有較高的激活作用，其中Mn2+的激活作用最大，Fe2+和Zn2+對粗蛋白酶活性有明顯抑制作用。

圖6 溫度對粗蛋白酶活性的影響Fig.6 Effect of temperature on crude protease activity

圖7 熱穩定性Fig.7 Thermal stability

圖8 金屬離子對粗蛋白酶活性的影響Fig.8 Effect of metal ions on crude protease activity

3 結語

本研究從魷魚中分離篩選高產蛋白酶菌株，通過脫脂牛奶平板培養基和干酪素平板培養基初篩得到16株產蛋白酶菌株，結合福林酚法測定菌株的產蛋白酶活力，復篩得到10株產酶活力較高的代表菌株。經PCR鑒定，發現代表菌株屬于芽孢桿菌屬 （Bacillussp.）、普羅威登斯菌屬（Providenciasp.）、假單胞菌屬（Pseudomonassp.）。其中以 SW5 菌株產蛋白酶活力最高，粗酶活力可達257.67 U/mL，經鑒定為甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicusKC790303.1）。對SW5菌株的產酶特性進行初步研究發現其產粗蛋白酶的最適pH為6.0～8.0，在 pH 8.0～10.0 時酶較穩定；最適溫度為40℃，在30～50℃時具有較高酶活性，在35℃下保溫60 min后，仍保留80%以上的活性；金屬離子試驗發現終離子濃度為1 mmol/L時Mn2+、Ba2+和Ca2+對該菌株所產蛋白酶的酶活力均有較高的激活作用，Fe2+和Zn2+對其有明顯抑制作用。魚醬油發酵的溫度為40±5℃，該菌株所產蛋白酶能夠適應其發酵溫度，可以作為外源酶添加到魚醬油發酵中，通過分解魚肉蛋白影響其發酵液pH及風味，為魚醬油發酵提供一種新的蛋白酶來源。