米糠纖維床反應(yīng)器固定化發(fā)酵產(chǎn)丁酸的研究

周麗春，朱建忠，王文廣，蔡 謹(jǐn)，黃 磊，徐志南*

（1．浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州310027；2．杭州貝谷生物科技有限公司，浙江 杭州310013）

丁酸作為一種極為重要的大宗化學(xué)品已被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)[1]。在飼料行業(yè)，丁酸是一種生物調(diào)節(jié)劑，可以作為腸道細(xì)胞的能量來源，調(diào)節(jié)胃腸道微生物菌群和促進動物的消化吸收等[2]。因為游離性丁酸容易揮發(fā)，在飼料生產(chǎn)中通常將其制成相對穩(wěn)定的鈉鹽——丁酸鈉。丁酸鈉無污染、無有害殘留，具有獨特的營養(yǎng)生理功能，正逐漸成為熱門的抗生素替代品之一[3]。

丁酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法。目前，丁酸工業(yè)生產(chǎn)采用化學(xué)合成法。生物發(fā)酵法仍然無法與化學(xué)合成法競爭，其主要原因是：發(fā)酵周期長，產(chǎn)物分離難，生產(chǎn)成本高[4-5]。因此，開發(fā)一種更為簡便有效、成本低廉的發(fā)酵形式至關(guān)重要。美國俄亥俄州立大學(xué)楊尚天教授等人在傳統(tǒng)的填充床反應(yīng)器基礎(chǔ)上，設(shè)計出纖維床生物反應(yīng)器（Fibrous-Bed Bioreactor，F(xiàn)BB）， 使得固定化載體上一直保持較高的活細(xì)胞密度，提高了發(fā)酵產(chǎn)物的終產(chǎn)量、得率和生產(chǎn)率等，已應(yīng)用于乙酸、丙酸、丁酸和乳酸等多種有機酸發(fā)酵[6-9]。但該反應(yīng)器的固定床制作成本較高，且難以工業(yè)放大。

米糠作為稻谷加工的副產(chǎn)物，資源豐富，且價格低廉[10]。在飼料加工中，米糠是一種常用的飼料添加劑載體。同時，米糠也是一種纖維素材料，可用于細(xì)胞固定化。

本研究首次提出將低廉的米糠作為固定化載體，構(gòu)建了一種外置式纖維床反應(yīng)器（external fibrous-bed bioreactor）發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，發(fā)酵后直接將吸附了產(chǎn)物——丁酸鈉的米糠用作飼料添加劑。以簡化原有的提取丁酸，再添加到飼料制備過程中。開拓一條綜合利用飼料原料，高效、廉價生產(chǎn)飼料添加劑——丁酸鈉的新思路。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

酪丁酸梭菌 （Clostridium tyrobutyricumATCC 25755），由浙江大學(xué)生物工程研究所保藏。

種子培養(yǎng)基（g/L）：胰酪胨5，酵母粉 5，氯化鈉4.18，葡萄糖 30，痕量金屬溶液 10 mL，0.2%FeSO4·7H2O溶液2 mL。pH 6.0，沸水浴加熱除氧。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：胰酪胨5，酵母粉 5，氯化鈉4.18，葡萄糖50，痕量金屬溶液10 mL。

痕量金屬溶液 （g/L）：MnSO4·2H2O 0.5，CoCl20.1，CaCl2·2H2O 0.1，ZnSO4·5H2O 0.1，CuSO4·5H2O 0.1，KAl （SO4）20.01，H3BO40.01，Na2MoO4·3H2O 0.01。

1.2 種子液制備

將保藏的菌種以5%的接種量接種于含40 mL種子培養(yǎng)基的100 mL血清瓶中，于YQX-II厭氧培養(yǎng)箱 （上海躍進醫(yī)療器械廠）中37℃厭氧培養(yǎng)48 h，制成一級種子液。以5%的接種量繼續(xù)傳代，得到二級種子液。

1.3 游離細(xì)胞發(fā)酵

在5 L機械攪拌式發(fā)酵罐 （上海保興生物設(shè)備工程有限公司）中進行游離細(xì)胞發(fā)酵。2 L發(fā)酵培養(yǎng)基中接入100 mL二級種子液，37℃，150 r/min條件下發(fā)酵，通入氮氣以保證反應(yīng)器中的厭氧環(huán)境，利用6 mol/L NaOH控制發(fā)酵液pH值6.0。

1.4 外置式纖維床反應(yīng)器構(gòu)建

玻璃固定化柱（柱長：31 cm；內(nèi)部直徑：5 cm）帶有夾套，裝填80 g洗凈、烘干至恒重的米糠，兩端采用不銹鋼絲網(wǎng)固定，玻璃柱底部填充高約 15～30 mm的玻璃彈簧，其工作體積約為500 mL。將發(fā)酵罐與玻璃固定化柱分別滅菌，利用蠕動泵將二者相連接，采用循環(huán)恒溫水浴鍋控制固定化柱溫度，構(gòu)建為外置式纖維床反應(yīng)器（見圖1）。

1.5 固定化細(xì)胞發(fā)酵

發(fā)酵操作同游離細(xì)胞發(fā)酵，待發(fā)酵罐中OD600值達(dá)到6.0時即開啟纖維床生物反應(yīng)器，初始循環(huán)速度為30 mL/min，維持循環(huán) 36～48 h，進行菌體固定化培養(yǎng)，至發(fā)酵罐內(nèi)的游離菌體濃度不再降低，取出所有的發(fā)酵液并更換新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基 （2 L體系），提高泵的轉(zhuǎn)速至100 mL/min，開始進行固定化發(fā)酵。

1.6 米糠對丁酸鈉的吸附實驗

1.6.1 米糠吸附丁酸鈉模擬實驗移取50 mL濃度為30 g/L丁酸鈉溶液于250 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)溶液pH值為6.0，投加8.0 g的米糠，置于37℃搖床中進行振蕩吸附反應(yīng)（150 r/min），在時間為0.5、1、2、4、8、10 和 24 h 時后取出溶液并測定丁酸鈉的濃度。同時設(shè)置平行實驗和空白實驗。

式中：q為米糠吸附丁酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g/g；c0為空白對照丁酸鈉質(zhì)量濃度，g/L；ct為剩余丁酸鈉質(zhì)量濃度，g/L；v為溶液體積，L；m為米糠投加量，g。

1.6.2 固定化發(fā)酵后的米糠吸附丁酸鈉的測定用1%的磷酸溶液洗滌米糠，直至洗下溶液中丁酸鈉質(zhì)量濃度為0 g/L，定容后測洗下溶液的丁酸鈉含量。將米糠在80℃烘箱中烘干至恒重，測定其質(zhì)量M。吸附量為

式中：Q為發(fā)酵后的米糠吸附丁酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g/g；C為洗下溶液中丁酸鈉的質(zhì)量濃度，g/L；V為定容后的溶液體積，L；M為米糠的質(zhì)量，g。

1.7 分析方法

1.7.1 菌體含量測定游離細(xì)胞生物量的測定：采用紫外/可見光分光光度計于600 nm讀取菌懸液的OD600。

固定化細(xì)胞生物量（m1）的測定：發(fā)酵前測定固定化所用米糠的干重（m2），發(fā)酵后取出固定化菌體后的米糠，在在80℃烘箱內(nèi)烘干至恒重（m3）。固定化細(xì)胞生物量為（m1=m3-m2）。

1.7.2 葡萄糖含量測定采用SBA-40C生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）測定葡萄糖的含量。

1.7.3 丁酸和乙酸含量測定采用安捷倫6820型氣相色譜系統(tǒng)檢測，以內(nèi)標(biāo)法定量分析發(fā)酵液中丁酸和乙酸濃度。檢測所用檢測器為氫火焰離子化檢測器，色譜柱為HP-INNOWAX毛細(xì)管柱 （30 m×0.32 mm），流動相為高純氮氣，流速為3 mL/min。測定條件：柱溫250℃，進樣口溫度250℃。發(fā)酵液10 000 r/min離心后取上清液1 mL，加入內(nèi)標(biāo)物丙酸 30 μL，進樣量 0.4 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 游離和固定化細(xì)胞分批發(fā)酵產(chǎn)丁酸

進行了游離細(xì)胞和外置式纖維床反應(yīng)器固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的比較，結(jié)果如圖2所示。在游離發(fā)酵模式中，50 g/L的葡萄糖在64 h后被完全消耗，丁酸最終產(chǎn)量為19.84 g/L，生產(chǎn)率為0.31 g/L/h。而固定化細(xì)胞發(fā)酵模式中的葡萄糖在48 h后被完全消耗，丁酸最終產(chǎn)量達(dá)到22.85 g/L，生產(chǎn)率達(dá)到0.48 g/L/h，比游離發(fā)酵分別提高了15%和55%。同時糖酸轉(zhuǎn)化率與游離細(xì)胞發(fā)酵相比提高了13%（0.46 g/g vs.0.40 g/g），發(fā)酵時間從 64 h 縮短到48 h。因此，外置式纖維床固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)丁酸比游離發(fā)酵具有明顯的優(yōu)勢。從圖2中可以看出，固定化細(xì)胞分批發(fā)酵模式可以縮短菌體的遲滯期。這一研究結(jié)果與其他類似的纖維床反應(yīng)器發(fā)酵的結(jié)果基本一致[11-12]。

圖2 游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞分批發(fā)酵產(chǎn)丁酸Fig.2 Batch fermentation for butyric acid production with free-cell and immobilized-cell

2.2 固定化細(xì)胞補料分批發(fā)酵產(chǎn)丁酸

如圖3所示，初始葡萄糖質(zhì)量濃度為50 g/L，所有的葡萄糖（135 g/L）在165 h后被消耗完，共產(chǎn)生30.69 g/L的丁酸。糖消耗速率和丁酸生產(chǎn)速率在每次補料后都有所降低，這是由于隨著丁酸濃度的增加，產(chǎn)生了產(chǎn)物抑制，這與文獻(xiàn)[12]的研究結(jié)果一致。文獻(xiàn)[11]發(fā)酵結(jié)果表明固定化補料分批模式有利于提高丁酸的產(chǎn)量，而本實驗采用補料分批模式未見丁酸產(chǎn)量有明顯提高，因此推測作為固定化介質(zhì)的米糠對發(fā)酵液中的丁酸鈉存在吸附作用。

圖3 固定化細(xì)胞補料分批發(fā)酵產(chǎn)丁酸Fig.3 Fed-batch fermentation for butyric acid production with immobilized-cell

2.3 米糠對丁酸鈉的吸附

2.3.1 米糠對丁酸鈉吸附的模擬實驗在與發(fā)酵條件基本一致的情況下 （丁酸鈉30 g/L，pH 6.0，溫度37℃）進行了米糠對丁酸鈉的吸附模擬實驗，實驗結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，米糠對丁酸鈉的吸附量隨時間的延長而逐漸增加，最后達(dá)到吸附平衡。吸附開始的前8 h，吸附量增加迅速，8 h后，吸附量增加緩慢并逐漸趨向吸附平衡，最終平衡吸附量可以達(dá)到0.084 g/g。

圖4 米糠對丁酸鈉的吸附Fig.4 Adsorption of sodium butyrate by rice bran

2.3.2 固定化發(fā)酵后的米糠對丁酸鈉的吸附將固定化補料分批發(fā)酵后的米糠取出烘干后，對其上吸附的丁酸鈉和酪丁酸梭菌的量進行了測量，實驗結(jié)果可得，作為固定化介質(zhì)后的米糠對酪丁酸梭菌的吸附量為0.106 g/g，對丁酸鈉的吸附量為0.105 g/g。固定化發(fā)酵后的米糠對丁酸鈉的吸附量略高于模擬實驗中米糠對丁酸鈉的吸附量，這可能是由于在固定化發(fā)酵的長期過程中，米糠的結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化，提高了米糠對丁酸鈉的吸附效率，此外，米糠會吸附酪丁酸梭菌，菌體中含有的丁酸鈉也會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。在飼料添加中，丁酸鈉的添加量通常為0.2～3 kg/t，米糠的添加量通常為50 kg/t，二者的添加比例為0.004～0.06 g/g。固定化后的米糠經(jīng)適當(dāng)稀釋后可保持與飼料添加中米糠和丁酸鈉的添加比例一致，這一發(fā)酵模式可為飼料添加提供參考。在飼料添加中，可以利用米糠作為固定化載體，發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，待發(fā)酵結(jié)束后直接將米糠投加到飼料中，米糠所吸附的丁酸鈉可以滿足動物的營養(yǎng)需求。同時米糠吸附的酪丁酸梭菌作為益生菌有著優(yōu)異的益生、防病作用，在替代抗生素、防治疾病和改善環(huán)境方面起到了很好的作用[13]。

2.4 固定化重復(fù)分批發(fā)酵產(chǎn)丁酸

為了觀察外置式纖維床反應(yīng)器的長期穩(wěn)定性能，采用了固定化重復(fù)分批發(fā)酵模式，實驗結(jié)果如圖5所示。在重復(fù)8次固定化分批發(fā)酵中，菌體的生長過程幾乎沒有遲滯期，底物消耗速度都很快。每次更換新鮮培養(yǎng)基時，菌體的生長均未出現(xiàn)遲滯期，表明固定在米糠纖維床反應(yīng)器內(nèi)的菌體具有較高的活性且穩(wěn)定。所有批次中的丁酸質(zhì)量濃度在19.03 g/L到22.58 g/L間，平均值為21.05 g/L。丁酸生產(chǎn)率從0.36 g/L/h到0.45 g/L/h不等，平均值為0.40 g/L/h。文獻(xiàn)[14]利用菊芋水解液重復(fù)分批發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，10個批次的丁酸產(chǎn)量保持穩(wěn)定，本文的研究結(jié)果與其一致。

圖5 固定化細(xì)胞重復(fù)分批發(fā)酵產(chǎn)丁酸Fig.5 Repeated-batch fermentation for butyric acid production with immobilized-cell

3 結(jié)語

1）本研究構(gòu)建了一種新型的外置式纖維床生物反應(yīng)器用于酪丁酸梭菌固定化分批發(fā)酵丁酸，丁酸的生產(chǎn)率比游離發(fā)酵提高了55%。

2）米糠在發(fā)酵過程中吸附丁酸鈉的量與常規(guī)飼料中丁酸鈉的添加量基本一致，因此可以作為一種簡便快速的飼料添加新方式。

3）在固定化重復(fù)分批發(fā)酵模式中，得到丁酸的平均濃度為21.05 g/L，外置式纖維床反應(yīng)器展現(xiàn)了很好的穩(wěn)定性。這對于實現(xiàn)發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn)丁酸及丁酸鈉在飼料中的添加新途徑具有一定的指導(dǎo)意義。