黑曲霉內(nèi)切葡聚糖酶AnCel5A的表達(dá)純化與晶體優(yōu)化

顏俊杰，李玉潔，鄭迎迎，陳純琪，郭瑞庭，李華鐘*，劉衛(wèi)東

（1.江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308）

關(guān)鍵字：內(nèi)切葡聚糖酶；純化；結(jié)晶；結(jié)構(gòu)

近年來，隨著化石燃料的消耗以及因此導(dǎo)致的環(huán)境污染問題不斷加重，可再生能源的研究逐漸成為熱點(diǎn)。纖維素是公認(rèn)的新能源及化工領(lǐng)域的重要原材料，將其分解成可利用的單糖或多糖則是對其大規(guī)模利用的前提條件。與目前常用的物理化學(xué)降解方法相比，纖維素酶降解法具有高效、有條件溫和、設(shè)備要求低、污染小等優(yōu)點(diǎn)；纖維素酶[1]是一類起協(xié)同作用的多種水解酶組成的復(fù)合酶系[2]。從自然界微生物中分離得到的大多數(shù)纖維素酶常常有耐熱性差、活性低、不耐酸堿等缺陷，要將這些酶進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用，就需要對它們的這些劣勢進(jìn)行改造[3]。基于蛋白結(jié)構(gòu)信息的理性、半理性改造已被成功用于提高纖維素酶的活性、pH穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性等屬性[4-6]。通過研究了解纖維素酶的精細(xì)晶體結(jié)構(gòu)，可以有效指導(dǎo)實(shí)際改造工作。

本文研究的黑曲霉內(nèi)切葡聚糖酶（AnCel5A），屬于糖苷水解酶第5家族（GH5）下的A6亞家族[7]，作用于纖維素分子無定形區(qū)的內(nèi)部β-1，4-糖苷鍵[8]，其比活力高達(dá)204 U/mg[9]，而且能水解多種不同底物，這一特性使AnCel5A在工業(yè)、能源等領(lǐng)域擁有廣闊的前景。本文作者截去N端構(gòu)成信號肽的30個(gè)氨基酸，在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)[10-11]中對其進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)出來的截短的AnCel5A由302個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，含3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，相對分子量33.7 kDa、等電點(diǎn)pH 4.11，粗酶液切去糖基化后經(jīng)離子柱、疏水柱純化獲得純度95%以上的蛋白[12]。以氣相擴(kuò)散法[13-14]初步篩選出AnCel5A的初步結(jié)晶條件，對結(jié)晶條件優(yōu)化獲得了較好的晶體。通過對晶體衍射測試得知晶體衍射數(shù)據(jù)的分辨率，為后續(xù)確定相位信息[15]、結(jié)構(gòu)調(diào)整優(yōu)化獲得其晶體結(jié)構(gòu)做準(zhǔn)備。后續(xù)獲得的晶體結(jié)構(gòu)信息將能確定該酶的催化以及潛在熱穩(wěn)定性相關(guān)位點(diǎn)信息，為提高酶活及耐熱性等的改造提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑層析填料：購自美國GE公司；二喹啉甲酸 （bicinchoninic acid,BCA）蛋白濃度測試試劑盒：購自美國Thermo Fisher公司；酵母膏、蛋白胨、無氨基酸酵母氮源（YNB）：購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選試劑盒：購自美國Hampton Research和Emerald Biosystems公司；晶體優(yōu)化試劑：購自美國Sigma公司。

1.1.2 儀器恒溫培養(yǎng)箱：美國精騏公司；高速冷凍離心機(jī)：美國Thermo Fisher公司；臺式冷凍離心機(jī)：美國Thermo Fisher公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng)：美國GE公司；蛋白質(zhì)電泳儀：美國Invitrogen公司；Nano-drop超微量分光光度計(jì)：美國Thermo Fisher公司；光學(xué)顯微鏡：美國徠卡公司。

1.1.3 菌種畢赤酵母工程菌Pichia pastorisX33/pPICZαA-AnCel5A（由本實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.2 方法

1.2.1 重組菌株的表達(dá)將-80℃保存的甘油菌1 mL 接種到 100 mL YPD 培養(yǎng)基 （Zeocin+，100 μg/mL）中，30 ℃，250 r/min 振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.6～0.8。將YPD培養(yǎng)液平均接種到10瓶含500 mL BMGY培養(yǎng)基中（Amp+、Kan+，100 μg/mL），30 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng) 16～18 h，至 OD600=2～6。4 ℃沉降 6 h，傾去上清，沉淀細(xì)胞用等體積BMMY培養(yǎng)基重懸，繼續(xù)于30℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔24 h，加入終濃度1%的甲醇，總共誘導(dǎo)96 h。

1.2.2 發(fā)酵液收集與純化預(yù)處理發(fā)酵液經(jīng)5 500 r/min，4℃離心25 min后收集上清液。經(jīng)糖基化預(yù)測得知AnCel5A存在N-糖基化位點(diǎn)，因此需要用Endo H酶切去糖基化，按體積比1∶104向上清液中加入20 mg/mL的Endo H酶。將蛋白粗酶液透裝入透析袋放入 5 L（25 mmol/L Tris-Cl，pH 7.5）透析液中4℃透析除鹽，每隔6 h更換透析液，每隔12 h取樣SDS-PAGE電泳（設(shè)置未加酶空白對照），檢查酶切效果。

1.2.3 DEAE Sepharose 6 Fast Flow平衡液 A：25 mmol/L Tris-Cl，pH 7.5； 洗脫液 B：25 mmol/L Tris-Cl，1 mol/L NaCl，pH 7.5。層析柱用 A 液預(yù)平衡后上樣，上樣完成后A液淋洗平衡，B液設(shè)置條件0～100%，60 min，梯度洗脫，根據(jù)SDS-PAGE驗(yàn)證結(jié)果收集純度符合要求的蛋白。

1.2.4 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow平衡液 A：25 mmol/L Tris-Cl，1 mol/L（NH4）2SO4，pH 7.5，洗 脫 液B：25 mmol/L Tris-Cl，pH7.5。 調(diào)節(jié)樣品的電導(dǎo)和 pH值，層析柱A液預(yù)平衡后上樣，上樣完成后A液淋洗平衡后，B液設(shè)置條件0～100%，1 h，梯度洗脫，根據(jù)SDS-PAGE驗(yàn)證結(jié)果收集純度符合要求的蛋白。

1.2.5 超濾濃縮用Amicon Ultra截留相對分子質(zhì)量10 kDa超濾濃縮管，4℃，3 600 r/min條件下濃縮蛋白，分裝，凍存于-80℃。

1.2.6 蛋白質(zhì)濃度測定使用Nano-drop超微量分光光度計(jì)測定蛋白濃度。

1.2.7 純度分析用SDS-PAGE電泳分析蛋白質(zhì)純度：吸取1 μL濃縮蛋白于EP管中，加入 10 μL 2×上樣緩沖液，添加緩沖液至總體積20 μL；設(shè)置DTT有、無對照，確定蛋白在該條件下否有聚體。若SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示蛋白純度＞95%，則可以進(jìn)行后續(xù)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 AnCel5A蛋白結(jié)晶條件初篩、優(yōu)化及衍射數(shù)據(jù)收集采用坐滴蒸汽擴(kuò)散法進(jìn)行晶體生長條件初篩，初篩所用試劑盒包括Hampton公司和Emerald Biosystems公司生產(chǎn)的常用初篩試劑盒，以及Molecular Dimensions Ltd公司生產(chǎn)的JCSG-plus 1、JCSG-plus 2、ProPlex 1、ProPlex 2、PACT premierTM1、PACT premierTM2試劑盒。初篩條件總數(shù)1 320個(gè)，所用的96孔坐滴結(jié)晶板由Hampton公司生產(chǎn)，池液 100 μL，蛋白液與池液為 1 μL+1 μL，養(yǎng)晶環(huán)境為于22℃恒溫室，觀察時(shí)間間隔72 h。以初篩長晶條件為基礎(chǔ)，通過組合調(diào)整結(jié)晶條件中沉淀劑和鹽的種類及濃度、緩沖液的種類及pH、蛋白液濃度進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化晶體在臺灣新竹同步輻射中心進(jìn)行X光衍射及數(shù)據(jù)的收集和處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 糖基化酶切效果驗(yàn)證

糖基化可以在某種程度上使蛋白的柔性區(qū)增加，卻會(huì)對蛋白質(zhì)結(jié)晶產(chǎn)生不利影響，所以在蛋白晶體學(xué)研究中通常需要去糖基化。按比例向AnCel5A粗酶液中加入Endo H酶，透析于25 mmol/L Tris-Cl pH 7.5的緩沖液中酶切24 h。取樣跑SDS-PAGE蛋白膠驗(yàn)證酶切情況。AnCel5A蛋白在SDS-PAGE上的大小由酶切前的45 kDa左右變?yōu)?5 kDa，接近AnCel5A蛋白的理論分子量33.7 kDa，如圖1所示，其中泳道1代表EndoH酶切之前，泳道M代表標(biāo)準(zhǔn)蛋白帶Marker，泳道2代表EndoH酶切之后。

圖1 AnCel5A經(jīng)Endo H酶切的SDS-PAGEFig.1 Endo H enzyme digestion of AnCel5A

2.2 DEAE Sepharose 6 Fast Flow

在同一緩沖溶液中，不同蛋白表面所帶的電荷種類和數(shù)量各不相同，導(dǎo)致與離子交換介質(zhì)的結(jié)合能力有所區(qū)別，從而實(shí)現(xiàn)目的蛋白與雜蛋白的分離。因?yàn)锳nCel5A的等電點(diǎn)低于pH 7.0，因此它在pH 7.5的緩沖溶液中帶負(fù)電荷，所以選擇陰離子交換柱DEAE。A液平衡后樣品能很好地掛柱，流穿棕黃色但電泳結(jié)果顯示沒有蛋白，線性洗脫過程中目的蛋白逐漸被洗脫下來。如圖2所示，泳道2代表流穿，泳道3、4代表不同濃度洗脫液洗脫的蛋白。

圖2 DEAE陰離子交換層析Fig.2 DEAE Chromatography

2.3 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow

蛋白質(zhì)等生物大分子會(huì)因不同種類、數(shù)目的疏水性基團(tuán)分布在分子表面，造成蛋白質(zhì)分子間疏水性存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致異種蛋白質(zhì)與疏水性層析介質(zhì)之間的作用力強(qiáng)弱不同，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。AnCel5A蛋白中疏水性氨基酸如Met、Trp、Phe等約占總氨基酸的40%，大量的疏水性氨基酸的存在是依靠疏水性差異實(shí)現(xiàn)目的蛋白與雜蛋白分離的基礎(chǔ)。上樣過程中流穿呈現(xiàn)淺黃色，隨洗脫緩沖液濃度的提高目的蛋白被洗脫下來，電泳驗(yàn)證得知流穿的紫外吸收值較高是因?yàn)榱鞔┲泻猩亍Ｈ鐖D3所示，泳道1代表樣品，泳道2代表洗脫的蛋白。

圖3 Phenyl疏水層析Fig.3 Phenyl hydrophobic Chromatography

2.4 AnCel5A蛋白濃縮及濃度測定

AnCel5A濃縮后的蛋白濃度為22 mg/mL，濃縮產(chǎn)物SDS-PAGE驗(yàn)證結(jié)果如圖4所示。其中，泳道1代表濃縮后樣品。

圖4 濃縮后AnCel5A的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of concentrated AnCel5A

2.5 AnCel5A結(jié)晶蛋白初篩結(jié)果觀察

初篩晶體放在22℃恒溫晶體室培養(yǎng)，觀察后有疑似晶體生長，長晶條件如下：

1）Wizard III G5 （41#），條件：28%Polyethylene Glycol 400（PEG-400），0.1 mol/L HEPES pH 7.5，0.2 M Calcium chloride，晶體呈球形，見圖 5（a）；

2）Cryo I A6 （6#），條件：40% （v/v）Polyethylene Glycol 600 （PEG-600），0.1 mol/L cacodylate pH 6.5，0.2 mol/L Ca（OAc）2，晶體形狀片層狀，見圖 5（b）；

3）Cryo II A4 （4#），條件：40% （v/v） Polyethylene Glycol 400（PEG-400），0.1 mol/L HEPES pH 6.5，0.2 mol/L Ca（OAc）2，晶體呈塊狀見圖 5（c）。

圖5 AnCel5A初篩晶體Fig.5 Primary crystal of AnCel5A

2.6 結(jié)晶條件優(yōu)化及衍射數(shù)據(jù)收集

2.6.1 結(jié)晶條件優(yōu)化在初篩條件的基礎(chǔ)上，對條件中的沉淀劑和鹽的濃度進(jìn)行大范圍調(diào)整，觀察是否對晶體狀況有所改善以及是否需要對優(yōu)化得到的長晶條件小范圍調(diào)整。設(shè)置初調(diào)條件如下：

1）Wizard III G5 （41#）：（22，25，28，31，34， 37）%PEG-400，0.1 mol/L HEPES pH 7.5， （0.1，0.2，0.3，0.4） mol/L Calcium chloride；

2）Cryo I A6 （6#）：（25，30，35，40，45，50）% （v/v）PEG-600，0.1 mol/L cacodylate pH 6.5，（0.05，0.15，0.25，0.35） mol/L Ca（OAc）2；

3）Cryo II A4 （4#）， 條件：（32，34，36，38，40，42）%（v/v） PEG-400，0.1 mol/L HEPES pH 6.5，（0.1，0.2，0.3，0.4） mol/L Ca（OAc）2。

觀察結(jié)果顯示W(wǎng)izard III G5（41#）條件優(yōu)化出來的晶體較優(yōu)化前并無改善，見圖6（a）；Cryo II A4（4#）條件優(yōu)化長晶條件只在42%PEG-400這一列，最優(yōu)的晶體見圖 6（b）；Cryo I A6 （6#）條件優(yōu)化晶體狀況有所改善的PEG-600的范圍是35%～45%，見圖 6（c）嘗試對 Cryo I A6（6#）條件進(jìn)行細(xì)調(diào)如下：

Cryo I A6 （6#）：（34，36，38，40，42，44）% （v/v）PEG-600，0.1 mol/L cacodylate pH 6.5， （0.1，0.2，0.3，0.4） mol/L Ca（OAc）2。

將初步調(diào)整與細(xì)微調(diào)整的晶體狀況對比發(fā)現(xiàn)，Cryo I A6（6#）孔最優(yōu)的長晶條件是 35% （v/v）PEG-600，0.15 mol/L Ca（OAc）2，0.1 mol/L cacodylate pH 6.5。

2.6.2 衍射數(shù)據(jù)收集挑選優(yōu)化得到的蛋白晶體送到臺灣新竹同步輻射中心 （NSRRC），選擇BL15A1線站進(jìn)行X射線晶體衍射，得到衍射圖（圖7），確定晶體衍射解析度為1.8?。

圖6 AnCel5A優(yōu)化晶體Fig.6 Optimized crystal of AnCel5A protein

圖7 AnCel5A X-射線衍射圖Fig.7 X-ray diffraction image of AnCel5A

3 結(jié) 語

通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，獲得截短的內(nèi)切葡聚糖酶AnCel5A，發(fā)酵液依次通過EndoH酶切透析、DEAE離子交換層析和Phenyl疏水層析獲得高純度的AnCel5A蛋白。通過結(jié)晶條件初篩得出AnCel5A蛋白形成蛋白晶的沉淀劑為高濃度聚合度較低PEG（PEG-400和PEG-600），而且都含有0.2 M Ca2+；條件為 35% （v/v） PEG-600，0.15 mol/L Ca（OAc）2，0.1 mol/L cacodylate pH 6.5 時(shí)，晶體衍射圖的分辨率達(dá)到最高值1.80?。

AnCel5A屬于糖苷水解酶第5家族的GH-A家族，底物特異性廣泛。后續(xù)將對收集數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)精確修正，確定相角信息，獲得AnCel5A的三維結(jié)構(gòu)，并根據(jù)其結(jié)構(gòu)分析對活性區(qū)一些關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行有目的的突變改造，嘗試獲得高酶活、耐高溫的突變蛋白。