Cider Beer關鍵釀造工藝的研究

張 箐 ，劉春鳳 ，鄭飛云 ， 李永仙 ，王金晶 ，李 崎 *

（1.江南大學 教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

蘋果中富含多種酚類物質，包括類黃酮、原花色素[1]和酚酸類物質，可以有效預防癌癥、心臟病[2]、糖尿病[3]等心血管疾病，并有抑制人體衰老、抗腫瘤等功效。蘋果作為我國第一大果品，大多以鮮食為主，占蘋果總量的80%以上[4]；而蘋果的深加工主要為蘋果濃縮汁加工業，目前也出現嚴重的產能過剩，蘋果二、三級深加工是限制蘋果加工產業提高附加值的主要因素[5]。科學研究表明啤酒中約含有17種氨基酸，營養物質豐富，適量飲用啤酒有助于人體健康[6-7]。根據“2015中國啤酒業年度高峰論壇”報告顯示，我國啤酒在持續發展的情況下，2014年啤酒行業產量為4 921.9萬千升，出現了24年以來的首次負增長，預示著啤酒行業進入發展成熟期[7]。啤酒企業將從產品差異化、產品品質化和產品高端化等方面發力，滿足啤酒市場“低酒精、果味型、低濃度、功能型”的發展趨勢。

目前，國際上Cider Beer的釀造工藝主要有3種：1）果味型，通過在啤酒中添加香精、檸檬酸等香料制成，其果香非天然發酵型香氣；2）勾兌型，把啤酒與蘋果汁以不同比例勾兌制成，這種方法制得的產品穩定性差，較難推廣；3）發酵型，是以蘋果汁為主要原料，通過發酵和調配等方法釀造蘋果啤酒，在國際市場上比例逐漸提高。

本研究選取蘋果汁為原料，以貧氮條件下具有良好增殖能力和發酵能力的啤酒酵母為發酵菌株，同時結合啤酒釀造工藝研制而成。通過單因素實驗確定發酵工藝條件，利用正交實驗優化出產品較佳的發酵條件，為進一步大批量工業化生產提供依據。開展此研究，將有助于促進蘋果深加工，提高蘋果產業附加值，豐富飲料酒市場品類，加強啤酒市場的活躍度，具有很高的實用價值[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：10種不同品牌市售不含防腐劑的天然濃縮蘋果汁，6種不同品種市售蘋果，酒花 （青島大花），3 株啤酒酵母 （Q-03、D-8、C-05 分別編號為A、B、C）為本實驗室保藏。

試劑：果糖、酒石酸鉀鈉、碘酸鉀、氫氧化鈉、硫酸銅、甘氨酸、亞鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀等試劑均購于國藥集團（上海）化學試劑有限公司，分析純。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；生化培養箱BSP-250，上海博迅公司；阿貝折光儀，泰光有限公司；Kjeltec TM 8400全自動凱氏定氮儀，FOSS公司；低溫水浴槽，上海博迅公司；UV-2000分光光度計，FOSS公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 制作工藝濃縮蘋果汁→稀釋→調整pH→添加酒花→滅菌、冷卻→接菌發酵→過濾→Cider Beer成品。

1.3.2 蘋果汁的制備蘋果汁可以通過濃縮蘋果汁稀釋和蘋果榨汁后過濾兩種方式獲得。

1.3.3 常規指標檢測總氮（凱氏定氮法）、α-氨基氮、游離氨基酸和多酚采用ASBC分析方法進行檢測[9]。原麥汁質量濃度（密度瓶法）、還原糖（菲林試劑）、乙醇體積分數（密度瓶法）、總酸（電位滴定法）采用國標法進行檢測[10]。

1.3.4 蘋果汁糖組分檢測采用高效液相色譜法（HPLC），具體檢測條件為：色譜柱：Xbridge Amide色譜柱 （3.5 μm，4.6 mm × 250 mm i.d.）。 流速 1.0 mL/min；柱溫35℃；載氣壓力350 kPa；漂移管溫度50℃；增益 6。

1.3.5 發酵菌株的選擇

1）貧氮條件下菌株增殖能力檢測。取初始糖度為10%的純蘋果汁制作固體培養基，取5 μL菌液，分別以 1×105個/mL、1×104個/mL、1×103個/mL 菌濃，在培養基上進行菌落涂布培養，并隨時間記錄平板菌落個數。

2）貧氮條件下菌株發酵能力檢測。利用發酵菌株在10%的蘋果汁中進行發酵實驗，通過CO2失重法記錄每天失重量；主酵結束后檢測殘糖和α-氨基氮的質量濃度，并計算其利用率。

1.3.6 發酵取酵母泥接種于無菌蘋果汁中，用滅菌后的發酵栓將瓶口密封，11℃下發酵，每24 h搖瓶一次排出CO2后稱重，主酵結束后過濾發酵液，低溫保存待測。

1.3.7 單因素實驗選用較佳的蘋果汁原料和較佳的酵母菌株，在其他條件相同的情況下，采用不同的發酵溫度、發酵時間和酵母接種量用“1.3.6”進行發酵實驗，以“1.3.9”為標準進行感官品評，逐個考察各發酵條件對感官品評的影響，確定每一因素的最佳水平。

1.3.8 正交實驗根據“1.3.7”單因素實驗結果，使用發酵時間、發酵溫度和酵母接種量3個因素，進行L9（34）正交實驗，以感官評價作為評價指標（見表1）。

1.3.9 感官品評該研究組織本校經過感覺品評培訓的老師及學生共40位，由品評小組打分（見表1）。

表1 Cider Beer感官評分標準表Table 1 Sensory evaluation criteria of Cider Beer

2.1 蘋果汁原料的選擇

在酵母增殖和發酵的前期，α-氨基氮是酵母所利用的重要氮源。啤酒酵母對α-氨基氮的質量濃度要求在160 mg/L左右，質量濃度過低會影響酵母的增殖和發酵[11-12]。針對不同來源的蘋果汁，檢測其還原糖和α-氨基氮質量濃度，結果如表2所示。

從表2可以看出，蘋果汁中α-氨基氮遠低于普通啤酒酵母對其要求，在相同條件下，濃縮蘋果汁的α-氨基氮質量濃度普遍高于鮮榨蘋果汁的α-氨基氮質量濃度，這可能與蘋果榨汁不徹底、過濾損失有關。剛榨出的蘋果汁中，含有大量的多糖、果膠和果皮果肉等固形物，會影響果汁的穩定性、阻礙酒液的澄清并且影響成品酒的風味和口感[13-14]，樣品7在α-氨基氮質量濃度上最高，進一步檢測其糖組分，檢測結果如表3所示。

由表3可知，蘋果汁中主要糖為果糖（64%）和葡萄糖 （33%），符合啤酒酵母發酵對糖的需求；另外，從產品工業化生產的角度考慮，以濃縮蘋果汁作為原料有利于原料的長久儲存和遠距離運輸。綜上，本實驗選取樣品7為釀制Cider Beer的原料。

表2 濃縮蘋果汁成分分析Table 2 Analysis of components in concentrated apple juice

表3 樣品7糖組分分析表Table 3 Analysis of carbohydrate components in concentrated apple juice 7

2.2 酵母菌株對Cider Beer發酵的影響

釀酒酵母是影響啤酒品質的重要因素之一，不同的酵母菌株有著不同的生理特性，其代謝副產物的種類及質量濃度不同會造成酒體風味和感官的差別，直接影響啤酒的質量[15]。

2.2.1 貧氮條件下菌株增殖能力檢測選取在貧氮條件下生長狀況較強的A、B和C菌株，通過固體培養基上涂布菌落計數的方式，對比3種酵母菌株的增殖能力，見表4。可發現，B和C兩株菌更適應純蘋果汁的貧氮環境，增殖速度快，且增殖能力強。

2.2.2 貧氮條件下菌株發酵能力檢測當發酵溫度為11℃，酵母接種量為1×107個/mL，選取A、B和C三株菌，在初始糖度為10%的純蘋果汁中進行發酵實驗，記錄每天CO2失重情況，主酵結束后對還原糖和α-氨基氮等指標進行檢測。具體發酵失重情況如圖1所示，對應理化指標檢測結果見表5。

表4 不同酵母在蘋果汁固體培養基上的涂布生長情況Table 4 Coating growth situation of yeast on solid medium

圖1 酵母發酵失重曲線Fig.1 Weight loss situation of yeast fermentation

表5 發酵前后理化指標檢測結果Table 5 Index detection results before and after fermentation

通過圖1發現，酵母A起酵最慢，在純蘋果汁條件下，不能很快的適應此環境，發酵能力最弱；而酵母C起酵最快，整體發酵能力強于酵母A和B，能夠較好的適應純蘋果汁的環境進行增至發酵。通過表5發現，貧氮條件下，在α-氨基氮的利用率以及糖的利用率方面，C的α-氨基氮的利用率為49.52%，而同等情況下A為14.24%，B為15.32%。綜合考慮，本實驗選取發酵菌株為酵母C。

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 溫度對Cider Beer發酵的影響發酵時間為7 d，酵母接種量為1×107個/mL，發酵溫度分別是8、11、14、18℃。在此條件下進行發酵實驗，確定發酵溫度，結果如圖2所示。

圖2 發酵溫度對Cider Beer的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on cider beer

由圖2可見，一定發酵時間內，隨著發酵溫度的增加，Cider Beer的感官品評的分值先增加后減少。在低溫發酵條件下，發酵周期較長，可使得蘋果汁中特有的揮發性香味物質生成，并且使酒體口感更協調，但是過低的發酵溫度，酵母起酵晚，發酵速率過低，而高溫發酵會造成揮發損失，使酒體淡薄[16]。

在發酵過程中，隨著溫度的升高，Cider Beer中的含糖量先增加后減少，當8℃條件下發酵，酵母起酵晚而造成發酵遲滯；綜合以上的因素，選擇發酵溫度為11℃。

2.3.2 發酵時間對Cider Beer的影響調整發酵溫度11℃、酵母接種量為1×107個/mL，發酵時間分別是4、6、8 d和10 d。在此條件下進行發酵實驗，并檢測其乙醇體積分數、糖度并進行感官品評實驗，結果見圖3。

發酵時間是影響啤酒外觀、口感和風味的重要因素，在一定的發酵時間內，啤酒外觀清亮度會隨時間增加而提高，香氣更協調，風味口感也會更宜人[17]。由圖3可見，感官品評得分在0～6 d內逐漸提高，在第6天時達到最大值，之后6～10 d感官品評指標不斷下降。在發酵過程中，酵母菌會持續進行代謝將糖分解為酒精，乙醇體積分數會隨著發酵時間逐漸升高。綜上所述，較適發酵時間為6 d左右。

圖3 發酵時間對Cider Beer的影響Fig.3 Effect of fermentation time on cider beer

2.3.3 酵母接種量對Cider Beer的影響酵母接種量是影響啤酒感官品評的重要因素，它會影響啤酒的風味物質形成和乙醇體積分數[18]。本研究在11℃的發酵溫度下，發酵時間6d，酵母接種量分別是6×106個/mL、8×106個/mL、10×106個/mL、12×106個/mL和16×106個/mL。在此條件下進行發酵實驗，確定較佳酵母接種量的范圍，結果如圖4所示。

由圖4可見，酵母接種量在6×106個/mL～10×106個/mL之間時，感官品評指標隨著酵母接種量的增加而提高。當酵母接種量在10×106個/mL～16×106個/mL之間時，感官品評指標隨著酵母接種量的增加而減少。由圖4還可以看出，在發酵過程中，糖度隨著酵母接種量的增加而整體呈現下降的趨勢，同時乙醇體積分數整體升高。當接種量在10×106個/mL時，糖度下降量和乙醇體積分數的升高量比較小；綜上所述，選擇較適接種量為10×106個/mL。

圖4 酵母接種量對Cider Beer的影響Fig.4 Effect of yeast inoculation quantity on cider beer

2.4 正交實驗結果

2.4.1 正交實驗結果與分析根據以上的單因素實驗結果，針對發酵溫度、發酵時間和酵母菌的接種量3個因素進行正交實驗，每個因素3個水平進行L9（34）實驗設計，如表 6 所示。

表6 實驗的因素水平表Table 6 Factors and levels of experiment

由表7中各因素k和R的大小，對結果進行分析；通過極差R分析判斷，各因素對感官指標影響的主次順序是：發酵溫度＞發酵時間＞酵母接種量。并通過感官指標得出較佳條件為A2B3C1，即發酵溫度為11℃，發酵時間為7 d，酵母接種量為8×106個/mL。

表 7 L9（34）正交實驗結果與分析Table 7 L9（34） orthogonal experiment results and analysis

根據表8進行方差分析，其中C的平均方差小于2倍的誤差e的平均方差，為了提高F檢驗的靈敏度，我們將C的偏差平方和、自由度并入誤差e的偏差平方和、自由度。通過F比值與F臨界值的對比，A與B為主要因素，而C為次要因素，其中A與B對感官指標有非常顯著的影響，并且各因素對感官指標影響的主次順序是：A>B>C，這與極差分析所得結果一致。

表8 正交實驗方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal experiment

2.4.2 最佳工藝條件驗證由正交優化實驗得到較佳工藝條件，即發酵溫度為11℃，發酵時間為7 d，酵母接種量為8×106個/mL，為了驗證工藝條件可靠性，采用該發酵條件進行發酵實驗，并將最終產品與市售19種蘋果酒進行同時進行感官品評實驗，并分別檢測其總糖、總酸、游離氨基酸和多酚質量濃度，結果如表9所示。

表9 驗證結果與市售產品感官品評和理化指標Table 9 Result of sensory evaluation and index detection of the sample and products

對Cider Beer而言，入口合適的酸味可以讓口腔有“被充滿”的感覺，從而構成酒體的框架，讓酒體更飽滿，適宜的甜味讓啤酒更利口，恰當范圍的糖酸比是保持酒體協調的重要因素。由表9可見，口感品評得分較高的樣品（感官品評前9個）的總糖質量濃度在9.5～15 g/L之間，總酸質量濃度在7～10 g/L之間，相應的樣品更被消費者喜愛。本產品總糖質量濃度為13.28 g/L，總酸質量濃度為6.5 g/L，乙醇體積分數為2.85%mass，優化后感官品評得分為83.5，感官品評得分在20個樣品中排名第2，產品具有適宜的糖酸比，外觀為金黃色，口味醇正爽口，有明顯的果香味和酒花香氣，為消費者較喜歡的產品。本產品發酵度為46.51%，普遍低于其它樣品，確保以更低的乙醇體積分數和適宜的總糖來滿足國內消費者的口味偏好。

游離氨基酸和多酚是Cider Beer中重要的呈味物質和營養物質，氨基酸可以呈現甜、酸、澀、鮮、苦等味感[18]，一定量的多酚可以增加酒體的平衡感，使酒更豐滿。由表9可見，本產品游離氨基酸質量濃度為3.60 g/L，在20個樣品中排名第3，多酚質量濃度為1.04 g/L，在20個樣品中排名第8，具有豐富的營養。

3 結語

Cider Beer是一種以蘋果汁為原料，結合低溫啤酒釀造工藝研制的發酵型特種啤酒。本產品最終選取7號樣品的濃縮蘋果汁為發酵原料，選取酵母C為發酵菌株。通過正交實驗證明，發酵溫度與發酵時間作為主要因素，對最終發酵產品感官指標具有非常顯著的影響，各因素對感官指標影響的主次順序是：發酵溫度>發酵時間>酵母接種量。本產品選取較佳工藝條件是發酵溫度為11℃，發酵時間為7 d，酵母接種量為8×106個/mL，所得產品的總糖質量濃度為13.28 g/L，總酸質量濃度為6.5 g/L，乙醇體積分數為2.85%mass，發酵度為46.51%，游離氨基酸質量濃度為3.60 g/L，多酚質量濃度為1.04 g/L；經主酵過濾后所得Cider Beer外觀為金黃色，口味醇正爽口，果香味和酒花香氣明顯，口味獨特、營養豐富。