絲素接枝含酪氨酸多肽對其酶促改性的影響

朱雪珂，周步光，王 平，崔 莉，季 吉，王 強，范雪榮

（江南大學 生態紡織教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

京尼平（Genipin，GP）是梔子苷經 β-葡萄糖苷酶水解后的產物，是傳統中藥杜仲的活性成分之一，是從京尼平苷中分離、提純而獲得的。京尼平屬于環烯醚萜類化合物，作為優良的天然交聯劑，可以與含游離氨基的高分子（如蛋白質、膠原和殼聚糖等）交聯構建生物材料[1-3]。絲素（SF）是一類天然蛋白類高分子，具有良好的機械性能、生物相容性和低免疫原性，在生物醫用材料領域得到應用。絲素蛋白由20多種氨基酸組成，盡管其中含酚羥基的酪氨酸殘基量接近10%，但由于其包埋在由甘氨酸和丙氨酸組成的疏水鏈中，在酪氨酸酶催化絲素改性中酪氨酸殘基可及度較低，從而影響了絲素酶促改性效率[4-5]。為提高絲素的反應性，可在其表面接枝含酪氨酸的多肽[6-7]，其中定制多肽GKGYGGYGK中酪氨酸的含量約為40%，賴氨酸含量約為32%。若借助于生物或化學方法將該多肽接枝到絲素蛋白上，通過提高絲素蛋白上酪氨酸殘基的含量，則可提升酪氨酸酶催化絲素接枝伯胺類分子的效率，利于改善絲素蛋白膜的性能。

本文作者借助于生物交聯劑京尼平，促使含酪氨酸的多肽在絲素蛋白表面接枝，分析多肽在絲素表面接枝效果及交聯機制，探究其對酪氨酸酶催化絲素蛋白接枝聚賴氨酸效果的影響，拓展基于酪氨酸酶法的酶促絲素蛋白改性效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

桑蠶絲織物（90 g/m2）；京尼平（GP，上海寶曼生物技術有限公司）；多肽（P，序列為GKGYGGYGK，鄭州派和泰德醫藥科技有限公司）；酪氨酸酶（TYR，1070 U/mg， 美 國 Worthington Biochemical Corporation）；ε-聚賴氨酸（ε-PL，鄭州拜納福生物工程股份有限公司）；無水氯化鈣、無水乙醇、冰醋酸、醋酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）。

UV-1800紫外可見分光光度計（SHIMADZU，日本）；高效液相色譜儀（Waters e2695，美國Waters公司）；KDII-0.05微機控制萬能強力試驗機 （深圳市凱強利實驗儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 絲素蛋白溶液的制備將脫膠后桑蠶絲織物以氯化鈣-乙醇體系 （摩爾比CaCl2∶CH3CH2OH∶H2O=1∶2∶8）溶解，在 70±2 ℃的水浴鍋中攪拌 3 h 后冷卻至室溫，透析3 d去除鹽組分，經離心去除雜質后得到絲素蛋白溶液。

1.2.2 京尼平交聯絲素蛋白和多肽以京尼平（4 g/L）在 37℃、pH 6.0條件下處理多肽（1.5 mmol/L）和絲素蛋白溶液（20 g/L），處理時間7 h；對照樣不加京尼平或多肽。

1.2.3 絲素蛋白膜的制備將1.2.2節中的反應液倒入聚四氟乙烯模具中，在-20℃下冷凍5 h，再在-50℃的冷凍干燥機中凍干24 h，制得絲素凍干膜；或將反應液在室溫條件下風干，制備絲素風干膜。

1.3 測試方法

1.3.1 UV-Vis光譜分析以UV-1800紫外/可見分光光度計測定絲素溶液反應體系的吸光度，記錄溶液在400～800 nm范圍內溶液吸光度的變化。

1.3.2 SDS-PAGE凝膠電泳取 20 μL樣品與 5 μL上樣緩沖液（5×）混合均勻，在100℃水浴中沸煮10 min，取5 μL混合液上樣到8%～16%梯度膠上，然后在蛋白質凝膠電泳儀上進行實驗，濃縮膠階段電壓100 V，分離膠階段電壓為200 V。電泳結束后，以考馬斯亮藍R-250染色，最后進行脫色。

1.3.3 體積排阻色譜（SEC）不同條件下處理樣品經離心和過濾后，借助高效液相色譜儀考察其分子量分布變化，實驗條件：BioSuite450凝膠色譜柱（7.8 mm ×300 mm，8 μm）、2414 RI Detector、2998 PDA Detector，流量 0.5 mL/min，流動相為 PBS（0.05 mol/L pH=7 磷酸鹽緩沖溶液，0.3 mol/L NaCl）。

1.3.4 紅外分析采用FTIR光譜儀的ATR模式，在波長范圍為4 000～650 cm-1內對不同的冷凍干燥膜樣品進行紅外光譜分析。掃描次數32次，分辨率4 cm-1。

1.3.5 熱重法-微商熱重法 （TG-DTG）使用熱重分析儀分別測定處理后的絲素膜的TG-DTG。條件為：樣品量約為2 mg，升溫速度：10℃/min，升溫范圍：30～500 ℃，N2氣氛（高純 N2，流量為 40 mL/min）。

1.3.6 機械性能的測定使用萬能材料試驗機對絲素風干膜進行機械性能測試，拉伸速度為40 mm/min，夾距為40mm。測試前樣品裁剪成80 mm×5 mm樣條，并放在恒溫恒濕箱（20℃，RH=65%）中平衡24 h，實驗中每個樣品進行10次重復試驗，樣品斷裂強度和斷裂伸長率分別如下。

1.3.7 絲素膜表面ε-PL接枝率測定溶液中ε-PL濃度測定采用Itzhaki比色法[8]。實驗中制作ε-PL與甲基橙吸光度的相關性標準曲線，其中當ε-PL的質量濃度在0～0.1g/L時，其濃度與吸光度A465具有良好的線性關系為

式中：C為ε-PLL的濃度；A為溶液在465 nm處的吸光值。

酶促絲素膜表面接枝ε-PL中，通過分光法測定吸光度，借助于標準曲線計算ε-PL的接枝率。

2 結果與討論

2.1 京尼平對絲素/多肽體系吸光度的影響

含酪氨酸的多肽分子鏈上含3個游離氨基，絲素蛋白分子端基及賴氨酸殘基中也含有一定量的氨基，GP可與多肽和絲素蛋白分子中的氨基反應，從而形成梔子藍色素，使反應體系呈藍色，借助于分光法可了解絲素蛋白的交聯效果[9-10]。

利用紫外可見光光譜掃描，檢測SF/GP/P體系溶液吸收光譜變化，其中京尼平和氨基酸反應后生成的梔子藍色素的特征吸收峰在600 nm附近。圖1中對照樣1、2、3和4溶液均無色，而樣品5和6呈藍色；圖2中在600 nm附近出現新的特征吸收峰，與溶液中呈現藍色相吻合，表明GP的交聯作用使得SF+GP和SF+GP+P中均有梔子藍色素出現。

圖1 京尼平反應后絲素/多肽體系溶液的色外觀Fig.1 Appearances of fibroin/polypeptide solutions after treated by GP

2.2 京尼平對絲素/多肽體系分子量分布的影響

京尼平可與氨基化合物上的游離氨基反應，或經過自身聚合后再與外源氨基化合物反應，形成分子內或分子間的共價鍵[11-12]。實驗中借助于SDSPAGE、HPLC[13-14]評價京尼平對絲素蛋白分子量的影響，結果如圖3和4所示。

圖2 京尼平處理絲素/多肽體系的紫外可見吸收光譜Fig.2 Absorbancesofsilk fibroin and polypeptide solution after GP treatment

圖3 京尼平交聯后絲素溶液SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGEs of fibroin and polypeptide after crosslinking with GP

GP和P的分子量較?。ǚ謩e為226和885），圖3中對應的泳道1和2沒有明顯譜帶；絲素蛋白分子量在幾萬到幾十萬的范圍內，泳道3沒有明顯的分子量集中分布譜帶；泳道4和泳道3的顏色深淺差別不大，說明在僅絲素蛋白和P存在時，兩者間未發生交聯反應；泳道5比泳道3的顏色要深一些，說明在GP作用下，絲素蛋白發生了自交聯；泳道6比泳道3和5的譜帶顏色都深，表明絲素蛋白在GP的作用下除了發生自交聯作用外，還存在P接枝到絲素蛋白上，同時P還可能作為橋梁連接絲素蛋白分子，使得溶液中蛋白分子量整體增加。為進一步驗證GP促進P接枝絲素蛋白的效果，采用尺寸排阻色譜（Size Exclusion Chromatography,SEC）凝膠柱檢測絲素蛋白分子量變化，結果見圖4。

圖4 京尼平交聯絲素蛋白的體積排阻色譜Fig.4 SEC chromatograms of fibroin and polypeptide after incubating with GP

圖4 中可以看出，GP（曲線1）和絲素SF（曲線3）最高峰值相應的保留時間分別為24.8 min和27.9 min，P（曲線2）最高峰對應的保留時間約為27 min；GP+SF（曲線 4）比 SF（曲線 3）的出峰時間略有縮短，這是由于GP使SF分子間發生了交聯；GP+SF+P（曲線5）的出峰時間比GP+SF（曲線4）有所提前，是因為更多絲素分子間通過P發生交聯。圖3和圖4結果表明，GP可引發絲素蛋白和多肽發生分子內或分子間交聯，導致絲素分子量整體增加，這與圖1溶液色外觀變化、圖2的吸光度結果一致。

2.3 京尼平對絲素/多肽結構及結晶度的影響

交聯絲素蛋白和多肽的之后，京尼平分子中六元環上的氧原子會被伯氨基的N取代，形成含叔胺N的雜環[1]，因此可以通過進行紅外光譜分析考察其結構的變化，結果見圖4和5。

圖5 京尼平紅外吸收光譜Fig.5 FTIR spectra of GP

由圖5可得，京尼平有一些明顯特征峰。1 684 cm-1附近的吸收峰為C=O的伸縮振動；1 621 cm-1強吸收峰為烯環上C=C的伸縮振動；1 153 cm-1和1 111 cm-1處的吸收峰是C-O的伸縮振動；881 cm-1附近的吸收峰，被認為是雜環上的C-H的伸縮振動區。京尼平為雜環化合物，含有多個活性基團，可與氨基反應生成深藍色素，從而起到交聯效果[1]。

圖6中絲素蛋白在酰胺 I、酰胺 II、酰胺III的峰分別出現在1 641、1 520、1 234 cm-1附近。在1 108 cm-1與887 cm-1波長處出現了新的吸收峰，其中1 108 cm-1代表了C-N伸縮振動，且此N原子是與氨基反應后形成的叔胺N原子，887 cm-1處的特征峰為雜環上C-H伸縮振動，證明了京尼平和絲素或多肽中的-NH2發生了交聯作用。曲線d中1 108 cm-1與887 cm-1波長處出現的峰的強度均比曲線c中的高，說明SF+GP+P樣品中有更多C-N和C-H，驗證了絲素蛋白和多肽間發生交聯?？疾旖z素蛋白接枝多肽膜材料的熱學性能，結果見圖7。

圖6 絲素/多肽凍干膜的ATR-FTIR光譜圖Fig.6 FTIR spectras of the freeze-dried membranes of fibroin/polypeptide

圖7 中改性絲素和空白樣的曲線變化情況基本一致，均有兩階段的質量損失。其中，第1階段的質量損失出現在30～200℃范圍內，是因為絲素膜表面或內部自由水蒸發引起；第2階段在200～500℃，最大分解速率在290℃附近，主要是由大分子熔融降解引起的。SF和SF+P樣品的失重溫度分別為291.52℃和294.52℃，經GP交聯之后，SF+GP和SF+GP+P樣品的失重溫度有所上升，分別是303.14℃和299.28℃，表明交聯后的絲素樣品熱穩定性提高。加入交聯劑后，交聯劑分子在相鄰大分子間有結合力，結合力使大分子相互靠攏，分子鏈間作用力增加，排列規整化，使得絲素膜結晶度有所增加，其穩定性也相應增加[13]。SF+GP+P樣品失重溫度比SF+GP略低，可能是由于部分絲素分子和多肽發生交聯，使絲素蛋白自身間交聯有所減少所致。

圖7 絲素/多肽凍干膜TG/DTG曲線Fig.7 TGA and DTG curves of the freeze-dried membranes of fibroin/polypeptide

2.4 京尼平對絲素/多肽風干膜機械性能的影響

考察京尼平對絲素/多肽膜結構的影響，對比加入0.1%（w/v）甘油條件下絲素/多肽風干膜的斷裂強力和斷裂伸長率，結果見圖8。

從圖8中可以看出，京尼平處理后絲素膜材料的拉伸強度略有增加，這是由于絲素蛋白和多肽經京尼平交聯后發生分子內或分子間交聯，其分子間作用力加強，拉伸強度增加。在受到外力拉伸時，SF+P和SF+GP+P膜中大分子鏈段間的滑動能力降低，膜材料斷裂伸長率略有下降。

圖8 絲素/多肽風干膜的機械性能Fig.8 Mechanical properties of the air-dried fibroin/polypeptide membranes

2.5 絲素接枝多肽對酪氨酸酶催化接枝ε-PL的影響

絲素蛋白接枝含酪氨酸多肽后，其酪氨酸含量增加，有利于提高酪氨酸酶催化氧化絲素產生更多醌類活性基[14-16]?？蛇M一步實現酶促絲素中醌類基團與外源功能性氨基化合物（如殼聚糖等）反應，改善絲素蛋白材料的應用性能[17]。實驗中以ε-PL氨基化合物模型物，考察經京尼平改性后絲素膜在酪氨酸酶催化下接枝ε-PL的效果，見圖9。

圖9 酪氨酸酶催化聚賴氨酸接枝多肽改性絲素膜Fig.9 Tyrosinase-catalysed grafting ε-Poly-L-Lysine on silk fibroin treated by polypeptide

由圖 9可知，SF/ε-PL樣品的吸附/接枝率為9.54%，其原因是ε-PL含有較多氨基，ε-PL等電點pI在9左右，而絲素蛋白pI為4.2～4.5，兩者可依靠庫侖力、范德華力或氫鍵結合，吸附在絲素膜表面。SF/TYR+ε-PL樣品中 ε-PL的吸附/接枝率為19.99%，高于SF/ε-PL，表明酪氨酸酶可催化ε-PL接枝絲素。SF+GP+P/TYR+ε-PL上ε-PL的吸附/接枝率為37.43%，高于其他樣品，表明絲素接枝含酪氨酸多肽后其反應性增強，酪氨酸酶催化絲素氧化的反應位點增多，因此ε-PL在絲素膜表面的接枝效率提高。

3 結 語

1）京尼平能促進絲素蛋白與含酪氨酸多肽中伯胺基之間反應，引發生成梔子藍色素；京尼平處理后絲素/多肽體系的蛋白分子量增加，實現了多肽在絲素蛋白表面的接枝。

2）含酪氨酸多肽和絲素交聯后，不僅使絲素膜材料的熱穩定性提高，也在一定程度上增加了絲素蛋白膜材料的機械性能。

3）多肽在絲素蛋白分子表面接枝后，使得絲素蛋白中酪氨酸含量增加，提高了酪氨酸酶催化ε-PL在絲素表面的接枝效果，驗證了通過接枝含酪氨酸多肽可提高絲素的酶促反應性。