不同粒徑大小的甘露糖修飾聚合物膠束制備及其靶向藥物輸送應用

汪家偉 ，張 權 ，2，葉 舟 ，崔晨宇 ，尹 健 *，2

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

癌癥是目前人類面臨的最大健康難題，據世界衛生組織（WHO）預計，2030年全世界將會有約1 200萬人死于癌癥。在近五十年的癌癥治療史上，化療已然成為最有效的手段之一，在臨床研究中涌現出了500多種抗癌藥物，但是癌癥的死亡率仍然高達20.2%。其中，主要原因在于抗癌藥物的毒副作用以及癌細胞的多藥耐藥性[1-2]。因此，如何提高藥物的療效并減少毒副作用，以及克服癌細胞的耐藥性一直是研究者亟需解決的問題。近年來，科研人員將飛速發展的納米技術與傳統化療創造性的結合，設計出了新型的靶向給藥系統，為癌癥的治愈帶來了光明的前景。目前，用于新型靶向給藥輸送的納米載體種類繁多，應用較為廣泛的主要有聚合物膠束[3-4]、脂質體[5]、樹枝狀大分子[6]和介孔硅納米粒子[7-8]等。

利用聚合物膠束為藥物載體輸送抗癌藥物，以提高藥物的靶向性和克服癌細胞的耐藥性已經引起了廣大科研工作者的關注[9-10]。聚合物膠束主要通過兩親性分子的自組裝而得到，形成親水外殼和疏水空腔的結構，其疏水空腔為難溶性藥物提供了一個良好的載藥環境。在體內，聚合物膠束具有良好的穩定性和生物相容性，并能通過增強滲透與滯留（EPR）效應實現腫瘤的被動靶向，提高疏水藥物的生物利用度。載藥聚合物膠束通過EPR效應到達腫瘤區域的過程中，為了不被體內的免疫系統所識別而被快速清除，延長載藥膠束在血液中的長時間循環，其中，膠束尺寸至關重要。一般腫瘤血管的孔洞直徑小于400 nm，體內的腎臟會清除10 nm以下及肝臟會清除100 nm以上的納米顆粒，所以制備聚合物膠束直徑的合適尺寸為10～100 nm。另外，針對不同腫瘤，不同尺寸的載藥膠束穿透能力差別很大，從而對治療效果造成很大影響[11]。因此，制備粒徑可調控的聚合物膠束有助于最大限度地發揮納米載體的EPR效應，從而提高藥物載體對腫瘤組織的被動靶向功能。

在聚合物膠束表面引入對癌細胞具有特異性識別作用的功能配體，如葉酸[12]、促黃體生成素釋放激素[13]、多肽[14]、抗體[15]等，通過配體-受體介導的內吞作用可以有效提高癌細胞對于載藥膠束的攝取。近年來，利用某些腫瘤細胞表面存在著高表達的甘露糖受體，在納米載體表面修飾上甘露糖分子，通過受體與甘露糖分子的特異性識別，以實現抗癌藥物的靶向輸送，已經得到證明[16-17]。但是，在兩親性聚合物膠束上引入甘露糖分子，以實現癌細胞的靶向藥物輸送的研究卻鮮有報道。

本文作者通過原子轉移自由基聚合（ATRP）以及"click"反應合成了具有不同嵌段比的甘露糖修飾的兩親性聚合物，采用核磁共振氫譜（1H-NMR）、透射電鏡（TEM）、動態光散射（DLS）等表征手段，確認分子結構并考察不同嵌段比聚合物形成膠束的形貌和粒徑變化情況。同時，以阿霉素為模型藥物，通過細胞實驗研究甘露糖修飾的載藥膠束對人乳腺癌細胞MDA-MB-231的抑制作用，并考察其對正常細胞HEK293的毒性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

丙烯酸（分析純）、2，2-二甲基-1，3-二氧戊烷-4-甲醇（Solketal，99%）、1，1，4，7，7-五甲基-二乙烯基三胺 （PMDETA，99%）、甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA，97%）、 三氟甲磺酸三甲基硅酯（TMSOTf，99%）、2，2'-聯吡啶 （Bpy，99%）、 苯甲酰氯 （分析純）、（+）-L-抗壞血酸鈉（99%）、五水硫酸銅（98%）、2-溴丙酸甲酯（MBrP，99%）均于百靈威科技有限公司購買；D-甘露糖（D-Mannose，分析純）、鹽酸阿霉素（DOX·HCl，99%）分別購于國藥集團化學試劑有限公司與北京華奉聯博科技有限公司。

1.2 主要儀器

AVANCE 400M型核磁共振儀，德國Bruker公司；Nexus 470紅外光譜儀，美國Nicolet公司；Nano ZS動態光散射儀（DLS），英國 Malvern公司；JEM-2 100透射電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會社；激光共聚焦顯微鏡（CLSM），日本尼康株式會社。

1.3 PSA-b-PGMA-Mannose聚合物膠束的制備合成

1.3.1 炔丙基-α-D-吡喃甘露糖的合成按照文獻[18]制備炔丙基-α-D-吡喃甘露糖。

1.3.2 單體甲基丙烯酸丙酮縮甘油酯（SA）的合成按照文獻 [19]制備單體甲基丙烯酸丙酮縮甘油酯（SA）。

1.3.3 PSA-b-PGMA-Mannose的合成 將3.4 g單體SA溶解于1.7 mL的環己酮中，通入氬氣15 min，以保證瓶內的無氧環境，依次加入130.4 mg CuBr、189.6 μL PMDETA，密封燒瓶，在氬氣的保護下，向瓶中注入101.2 μL的引發劑MBrP，在90℃油浴下反應13 h。反應結束后，向瓶中加入THF10 mL以終止反應，并置于空氣中攪拌1 h。將瓶內混合液通過中性氧化鋁柱，收集所得淺色液體，旋轉蒸發除去溶劑，將瓶內粘稠液體逐滴加于正己烷中沉淀，反復三次，將所得沉淀干燥即可得聚甲基丙烯酸縮丙酮甘油酯（PSA）。

將2 g的PSA溶解于1.4 mL的二甲亞砜中，通入氬氣15 min，以保證瓶內的無氧環境，依次加入56.4 mg CuBr，2.8 g GMA 和 83 μL PMDETA， 密封燒瓶，在氬氣的保護下，40℃油浴下反應3 h。反應結束后，向瓶中加入THF 10 mL以終止反應，并置于空氣中攪拌1 h。將瓶內混合液通過中性氧化鋁柱，收集所得液體，旋轉蒸發除去溶劑，將瓶內粘稠液體逐滴加于正己烷中沉淀，反復三次，將所得沉淀干燥即可得產物PSA-b-PGMA。保持PSA當量不變，調節反應中單體GMA的當量，即n（PSA）∶n（GMA）=1∶50，1∶90，1∶120，1∶150 合成具有不同嵌段比的聚合物。

將200 mg PSA-b-PGMA溶解于4.5 mL N，N’-二甲基甲酰胺中，依次加入46.8 mg疊氮化鈉和38 mg氯化銨，在50℃油浴下反應12 h。反應結束，將瓶內溶液過濾，旋轉蒸發除去溶劑，將瓶內粘稠液體加入水中沉淀，反復三次，將所得沉淀干燥即得產物PSA-b-PGMA-N3。

取燒瓶1，稱取50 mg PSA-b-PGMA-N3加入其中，再加入2 mL DMF進行溶解，通入15 min氬氣。另取燒瓶2，依次將44 mg炔丙基-α-D-吡喃甘露糖、50 mg五水硫酸銅晶體以及86 mg（+）-L-抗壞血酸鈉加入其中，用1.5 mL蒸餾水進行溶解，向瓶內通入15 min氬氣。充分溶解后，將燒瓶2內水溶液緩慢滴加到燒瓶1中，攪拌，繼續通入氬氣10 min，密封燒瓶，在油浴70℃反應2 d。過濾反應液，在透析袋（MW10000）中透析3 d，每4 h換一次水，冷凍干燥透析袋內溶液，得到目標產物PSA-b-PGMA-Mannose。

1.4 載藥聚合物膠束的制備

將50 mg鹽酸阿霉素和3當量的三乙胺溶解在10 mL蒸餾水中，室溫下攪拌4 h，期間嚴格避光，用二氯甲烷進行萃取（20mL×3），旋轉蒸發除去溶劑，真空干燥12 h后即得脫鹽后的阿霉素（DOX）。取4 mg脫鹽DOX溶解在4 mL DMSO中，靜置后經0.45 μm濾膜過濾待用。另將PSA-b-PGMA-Mannose溶解在5 mL DMSO中，并用0.45 μm濾膜過濾待用。

分別取適量上述待用溶液混合攪拌，并逐滴加入磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）8 mL，攪拌 1 h。 隨后將混合液移至透析袋（MW10000）中，在同樣的PBS體系中透析3 d，每隔4 h換一次水，最后將透析袋內溶液冷凍干燥3 d，即得到負載阿霉素的聚合物膠束（DOX@PSA-b-PGMA-Mannose）。

1.5 載藥膠束的細胞內吞

將對數期生長的MDA-MB-231和HEK293兩種細胞分別在培養皿中接種，貼壁后，加入40 μg/mL的DOX@PSA-b-PGMA-Mannose溶液再培養，一天后，移去培養液，并用PBS溶液清洗2次。然后，進行細胞的固定染色，具體操作：用1 mL 4.0%甲醛溶液固定細胞20 min。再用染料DAPI染色細胞核20 min[20]。在激光共聚焦顯微鏡下觀察DOX@PSA-b-PGMAMannose載藥膠束在兩種細胞內部的分布情況，設置405/561為激發波長，發射波長則設置為417-477/570-1 000。

對MDA-MB-231的甘露糖封堵試驗，即提前將5 mg/mL濃度的甘露糖水溶液與細胞共同培養4 h，然后再加入載藥膠束共同培養，接下來的操作與上述一樣。

1.6 細胞毒性評價

采用MTT法考察DOX@PSA-b-PGMAMannose載藥膠束對的MDA-MB-231和HEK293兩種細胞的細胞毒性[21]。將兩種細胞以10000/孔接種在96孔板中，培養一段時間后，將載藥膠束DOX@PSA-b-PGMA-Mannose或原藥DOX的血清培養基加入孔板中共培養，兩天后，移去孔中培養液，并以PBS清洗2次，然后，將100 μL MTT溶液（1 mg/mL）更換為 100 μL DMSO，搖床震蕩 15 min。在酶標儀上測定波長490 nm處的吸光度值（OD）。

2 結果與分析

2.1 兩親性嵌段聚合物PSA-b-PGMA-Mannose的合成

兩親性嵌段聚合物PSA-b-PGMA-Mannose的合成示意圖，如圖1所示。以MBrP引發SA聚合，得到聚合物PSA；再以聚合物PSA引發不同反應當量的GMA聚合，得到不同嵌段比例的聚合物PSA-b-PGMA，通過核磁氫譜計算得到的聚合物分別為PSA30-b-PGMA23，PSA30-b-PGMA45，PSA30-b-PGMA90，PSA30-b-PGMA115，其中 PSA30-b-PGMA45核磁氫譜見圖2（a）。合成的PSA-b-PGMA中存在的環氧基團易和疊氮化鈉進行開環反應，從而在聚合物上引入疊氮基團，得到PSA-b-PGMA-N3。利用“click”反應，在疊氮基修飾的兩嵌段聚合物上成功引入甘露糖分子，即得到PSA-b-PGMA-Mannose，核磁結果如圖2（b），其中，在8.17 ppm處出現了三氮唑氫的特征峰，標志著“click”反應的成功。

圖1 兩親性嵌段聚合物PSA-b-PGMA-Mannose的合成示意圖Fig.1 Synthetic route of the PSA-b-PGMA-Mannose

2.2 嵌段聚合物的紅外光譜分析

依次分別將聚合物PSA30-b-PGMA23、PSA30-b-PGMA23-N3以及PSA30-b-PGMA23-Mannose干燥粉末1 mg和無水溴化鉀100 mg混合，充分研磨后壓片，在4 000～400 cm-1進行掃描[22]，結果如圖3所示。可以看到在1 720 cm-1處PSA30-b-PGMA23光譜有較強的C=O峰；當引入疊氮基團后，圖3中B曲線中，在2 106 cm-1處出現了疊氮基團特征峰；而當PSA30-b-PGMA23-N3與炔丙基-α-D-吡喃甘露糖反應后，疊氮基團特征峰的消失，驗證了“click”反應的發生以及甘露糖的成功修飾（圖3中C曲線）。

圖2 嵌段聚合物的核磁共振1HNMR譜圖Fig.2 1HNMR spectra of the polymers

2.3 不同嵌段聚合物膠束的TEM與DLS表征

通過DLS測定不同嵌段比例膠束的流體力學直徑，并且觀察它們粒徑之間的變化趨勢，結果見圖4。實驗結果發現，4種不同嵌段比的膠束平均粒徑分別為255，105，78，24 nm。可以發現隨著親水嵌段的比例增大，膠束的粒徑減小。選取空白膠束PSA30-b-PGAM115-Mannose，當其負載DOX后，平均流體力學直徑由24 nm增大為97 nm（圖5）。

圖3 嵌段聚合物的紅外光譜Fig.3 FT-IR spectra of the polymers

通過TEM觀察不同嵌段比例膠束的形貌，結果見圖6，實驗結果表明膠束呈球形，粒徑分散均勻，分散性較好，而且和DLS測定的結果相似，隨著親水嵌段比例的增大，電鏡圖中的膠束粒徑越來越小。根據文獻[11]，通常聚合物膠束粒徑在50～100 nm之間時，其在體內具有顯著的EPR效應，有利于在腫瘤部位的富集。故接下來的體外藥物釋放和細胞水平實驗，選取平均粒徑為78 nm的PSA30-b-PGMA90-Mannose作為藥物載體進行評價。

圖4 空白膠束在水溶液中的流體力學直徑分布Fig.4 Diameter and distribution of the blank micelles

2.4 體外藥物釋放研究

通過分光光度計法可測得，載藥膠束DOX@PSA30-b-PGMA90-Mannose的載藥量為11%，包封率為22%。根據文獻報道，腫瘤組織微環境的pH值比正常組織低，當載藥膠束在血液（pH 7.4）循環時釋放藥物量較低，而在腫瘤處快速釋放大量藥物，可以使藥物選擇性地在腫瘤組織發揮藥效，并減輕對正常組織的毒副作用。因此，本文選擇了pH 7.4和pH 3.5兩種釋放介質以探究我們設計的聚合物膠束是否具有pH敏感性和緩釋性能。取載藥膠束DOX@PSA30-b-PGMA90-Mannose 1 mL，轉移至透析管中，在 37℃，25 mL的pH 7.4和pH 3.5緩沖液中分別測定DOX的藥物體外釋放，實驗全程避光。將燒杯置于恒溫震蕩培養箱中，設置恒定溫度為37℃，振蕩頻率為100 r/min。每隔一段時間吸取1 mL釋放介質，平行實驗3次，計算累積藥物釋放率，同時補加相同體積的介質。實驗結果如圖7所示，在pH 3.5的介質中，藥物釋放速度以及累計釋放率均高于在pH 7.4介質中的釋放。在pH 3.5的介質中，48 h累積釋放率可達到74.6%。實驗結果說明，作者設計的聚合物膠束顯示出了較好的pH敏感性和藥物緩釋性能，能夠很好地響應腫瘤組織的微環境而釋放藥物，從而減少對正常組織的毒副作用并增強治療效果。

圖5 空白膠束PSA30-b-PGAM115-Mannose載藥前后在水溶液中的流體力學直徑分布Fig.5 Diameter and distribution of the micelles

圖6 空白膠束的透射電鏡照片Fig.6 TEM images of the blank micelles

圖7 負載阿霉素的載藥膠束分別在pH 7.4和pH 3.5條件下的藥物釋放情況Fig.7 DOX release profile from DOX@PSA30-b-PGMA90-Mannose at pH 7.4 and pH 3.5，respectively

2.5 載藥聚合物膠束細胞內吞及攝取研究

選取載藥膠束DOX@PSA30-b-PGMA90-Mannose，通過激光共聚焦顯微鏡考察甘露糖受體介導的細胞內吞作用，其結果見圖8。分別以MDAMB-231癌細胞和HEK293正常細胞為細胞模型，其中僅癌細胞表面具有高表達的甘露糖受體，將載藥膠束DOX@PSA30-b-PGMA90-Mannose與細胞分別進行培養；另外，將MDA-MB-231癌細胞提前進行甘露糖封堵，再與載藥膠束DOX@PSA30-b-PGMA90-Mannose進行培養。在圖8（a）中可以看到，在癌細胞MDA-MB-231內出現較高強度的由DOX發出的紅色熒光，該現象可以說明載藥膠束DOX@PSA30-b-PGMA90-Mannose已被癌細胞大量攝取。而由圖8（b）可知，經過甘露糖封堵的MDA-MB-231癌細胞，由于MDA-MB-231細胞表面的甘露糖受體提前與甘露糖結合，所以再跟載藥膠束進行培養的時候，癌細胞表面幾乎沒有未被甘露糖封堵的甘露糖受體，所以攝取載藥膠束的能力極差，和未封堵的癌細胞有非常明顯的差異。由圖8（c）對于甘露糖受體低表達的HEK293細胞，細胞內紅色熒光強度同樣很低，說明幾乎沒有載藥膠束被攝入HEK293細胞內。上述實驗結果說明，我們所制備的甘露糖修飾的膠束具有良好的靶向性，可以被癌細胞表面的甘露糖受體特異性識別，通過內吞進入癌細胞內，然后藥物釋放發揮藥效，抑制癌細胞的生長；同時減少了載藥膠束被正常細胞識別內吞，從而降低抗癌藥物的毒副作用。

圖8 MDA-MB-231細胞，甘露糖封堵的MDA-MB-231細胞和HEK-293細胞分別對DOX@PSA30-b-PGMA90-Mannose的攝取情況Fig.8 Celluar uptake of DOX@PSA30-b-PGMA90-Mannose

2.6 空白膠束和載藥膠束的細胞毒性評價

選取空白膠束 PSA30-b-PGMA90-Mannose，實驗采用MTT法考察其對兩種細胞的毒性。配制5種濃度的空白膠束：0，25，50，100，200，500 μg/mL，分別與兩種細胞培養兩天，統計細胞存活率，結果如圖9所示。實驗結果表明，當空白膠束濃度增加到500 μg/mL時，兩種細胞存活率依然高達80%～90%，證明該空白膠束具有較好的生物相容性。

同樣采用MTT法評價載藥膠束DOX@PSA30-b-PGMA90-Mannose對兩種細胞的細胞毒性情況，并以等量的DOX作為對比，結果如圖10。由圖10（a）所示，對于癌細胞，載藥膠束DOX@PSA30-b-PGMA90-Mannose具有比DOX更強的細胞毒性；而由圖10（b）可知，對于正常細胞，載藥膠束具有比DOX較低的細胞毒性。這是因為甘露糖修飾的載藥膠束能夠特異性識別癌細胞表面高表達的甘露糖受體，并被內吞進入癌細胞；而低表達甘露糖受體的HEK293細胞無法識別甘露糖修飾的載藥膠束，所以內吞攝取載藥膠束的能力很低。

圖9 空白膠束對MDA-MB-231以及HEK293的細胞毒性Fig.9 Cytotoxicity of PSA30-b-PGMA90-Mannose against MDA-MB-231and HEK-293 cells

圖10 載藥膠束對MDA-MB-231和HEK-293的細胞毒性Fig.10 Cytotoxicity of DOX@PSA30-b-PGMA90-Mannose against MDA-MB-231 and HEK-293cells

3 結 語

本論文合成了不同親疏水嵌段比例的聚合物PSA-b-PGMA-Mannose，并利用這些嵌段聚合物制備膠束，研究膠束的形貌及粒徑變化情況，發現隨著親水嵌段的比例增加，膠束的流體力學直徑變小。選取膠束PSA30-b-PGMA90-Mannose，以阿霉素DOX作為疏水藥物，利用嵌段聚合物的疏水鏈段所形成的空腔包裹藥物DOX制備了載藥聚合物膠束DOX@PSA30-b-PGMA90-Mannose。研究其體外藥物釋放情況，并考察其對乳腺癌細胞MDA-MB-231的抑制效果。結果顯示，載藥膠束能夠被甘露糖受體特異性識別而內吞進入細胞內，并釋放藥物。本文制備的載藥膠束對癌細胞，具有比原藥DOX更高的細胞毒性，而毒副作用較低。因此，我們制備的聚合物膠束作為一種新型藥物載體有望應用于靶向治療癌癥。