基于2-酮基-D-葡萄糖酸高產的發酵條件優化研究

羅秋玲，劉 佳，張 權，楊 彬，陳修來，劉立明

（江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

2-酮基-D-葡萄糖酸 （2-Keto-D-gluconic Acid，2-KGA），屬于有機酸，是大宗生產產品，其主要應用于D-異抗壞血酸鈉 （sodium erthorbate，EN）以及 D-抗壞血酸（Erthorbate acid，EA）的合成，D-異抗壞血酸又稱異維生素C，在食品工業上被廣泛用為食品抗氧化劑[1]。目前，2-KGA的生產方法主要有酶法、化學合成法和發酵法，與其他方法相比，微生物發酵法生產2-KGA原料來源豐富、條件溫和、產品安全性好、視為純天然，從而是最具有競爭力的生產方法。

在自然界中，有許多微生物能發酵生產2-KGA，主要包括沙雷氏菌屬、假單胞菌屬和產堿桿菌屬[2]等。其中，因熒光假單胞菌易培養、發酵效價高等優點而被用作國內工業化發酵生產的菌株。但發酵過程中仍存在一些弊端：1）培養基氮源使用昂貴的有機氮源，蛋白胨、酵母膏等；2）發酵產物成分復雜，不利于下游提取等；3）滅菌不徹底易引發噬菌體污染。雖然可以通過篩選抗噬菌體菌株[3-4]、并采用發酵優化及固定化方式來降低噬菌體感染、提高發酵效價、降低下游提取難度，但仍避免不了噬菌體感染問題[5-7]。因此，篩選一株以無機氮為氮源的2-KGA生產菌株對工業化生產2-KGA以及擴大其在食品、化工及醫藥等領域的應用具有重要作用。

目前，國內工業化發酵生產2-KGA過程中使用無機氮源的報道較少。本研究以硫酸銨作為唯一氮源的沙雷氏菌屬Serratiasp.FMME043為出發菌株[8]，通過在30 L發酵罐上調控發酵補料和溶氧策略提高2-酮基-D-葡萄糖酸的產量，結果表明通過優化促進了葡萄糖向2-KGA轉化、提高了2-KGA的產量和生產強度，進而有效地降低了生產成本、分離純化難度以及噬菌體污染的風險，為后期放大實驗和工業化發酵生產提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種

菌種為沙雷氏菌Serratiasp.FMME043，由實驗室篩選保藏。

1.2 主要試劑與設備

2-酮基-D-葡萄糖酸鈣 （Sigma），Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），Bio Flo 115型30 L全自動攪拌式發酵罐 （瑞士Infors），UVmini-1240分光光度計（日本島津公司）。

1.3 培養基

斜面培養基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂0.2，pH 7.0。121℃滅菌15 min。

種子培養基 （g/L）：蛋白胨5，牛肉浸取物3，NaCl 5，pH 7.0，121 ℃滅菌 15 min。

發酵培養基（g/L）：初始葡萄糖100，初始硫酸銨濃度為 5，KH2PO41，Na2SO40.5，MgSO4·7H2O 0.8，MnCl2·4H2O 0.036，FeSO4·7H2O 0.036。 葡萄糖和硫酸銨分別單獨115℃滅菌15 min。

1.4 培養條件

斜面培養：將活化的保藏菌種接至斜面培養基上，在30℃培養箱中培養20 h。

種子培養：用接種針從斜面上挑取3～4環菌，接入種子培養基中（50 mL/500 mL），在30℃、200 r/min轉速下的搖床中培養12～14 h。

30 L發酵罐培養：30 L發酵罐中初始裝培養基16 L，溫度30℃，接種量13%，自動流加8 mol/L NaOH控制pH值在6.0。初始攪拌轉速500 r/min，通氣量24.0 L/min，隨著發酵的進行，DO由100%逐漸降低，當降到40%時，關聯轉速使DO維持在40%左右。發酵過程中每隔4 h取一次樣，并測定菌濃OD600、底物葡萄糖和產物2-KGA。

1.5 葡萄糖及2-KGA產物的檢測

取發酵液12 000 r/min離心5～10 min，收集上清液并稀釋相應倍數，用高效液相色譜 （HPLC）分析。HPLC條件見文獻[8]。

發酵生產2-KGA的糖酸轉化率計算為

2 結果與討論

2.1 葡萄糖補料方式對發酵的影響

在發酵生產2-KGA的過程中，若一次性投入過高濃度的葡萄糖等營養物質，會生成并積累大量的代謝副產物，并降低單位細胞轉化2-KGA能力；通過補料降低初始發酵培養基的黏度，可有效促進細胞對環境氧和營養成分的充分利用，并解除底物的抑制作用。此外，前期的搖瓶實驗發現，發酵初期葡萄糖濃度越低，生產2-酮基-D-葡萄糖酸生產強度越高[8]。

以前期實驗為基礎，在種子和發酵條件以及補料液相同的條件下，考察了發酵培養基的葡萄糖的初始濃度為100 g/L時，補加葡萄糖次數、補加時間對發酵產2-KGA的影響。采用以下3種補料方式進行發酵，補料分批發酵結果見圖1。

一次定量補料：當葡萄糖濃度降為15～25 g/L時，一次性補加含4 005 g葡萄糖補料液。

圖1 不同葡萄糖補料方式對2-KGA發酵的影響Fig.1 Effect of different glucose feeding modes on the production of 2-KGA

三次定量補料：當葡萄糖濃度降為15～25 g/L時，分3次相等的量進行補加（1 335 g/次），使發酵過程中補加總糖質量為4 005 g。

五次定量補料：當葡萄糖濃度降為15～25 g/L時，分五次相等的量進行補加（801 g/次），使發酵過程中補加總糖質量為4 005 g。

通過比較2-KGA的產量、產率和生產強度發現分五次相等量的補加葡萄糖策略的效果最好（圖1）。此時，2-KGA的產量、產率和生產強度分別達到245.7 g/L、0.96 g/g和5.12 g/L/h。出現這種情況的原因是通過補料降低了底物濃度、發酵液黏度，從而降低了底物抑制作用，并促進細胞對環境氧和營養物質的利用，提高了葡萄糖向2-KGA的轉化速率提高了2-KGA的生產強度[9]。

2.2 硫酸銨補料方式對發酵的影響

在微生物發酵時，氮源是維持菌體自身生長必要的生長因子，其量的維持是保證菌體生長和轉化的必要條件[10]，故考慮在發酵過程中根據菌體生長速率的變化加入適量的硫酸銨補充一定的氮源，保持菌體的正常生長和轉化。

在最優葡萄糖補料方式、維持種子和發酵條件以及補料液相同條件下，在發酵培養基的初始硫酸銨濃度為5 g/L時，采用以下3種補硫酸銨方式進行發酵生產。

一次定量補料：在發酵16 h，一次性補加含240 g硫酸銨補料液。

間歇定量補料：在發酵16 h補加含64 g硫酸銨補料液，22 h補加含80 g硫酸銨補料液，28 h補加含96 g硫酸銨補料液。

間歇恒速補料：在發酵16 h，就以1.25 g/L/h的速度流加硫酸銨補料液，直至含240 g硫酸銨補料液全部補完。

從圖2表明，硫酸銨的分次添加可以使發酵液中硫酸銨質量濃度維持在一個穩定的水平，既利于菌體的生長又利于葡萄糖向2-KGA的轉化。通過比較發現間歇定量補料方式效果最好，2-KGA的產量、糖酸轉化率和生產強度分別達到251.3 g/L，1.01 g/g和5.23 g/L/h。選擇間歇定量補硫酸銨方式。

圖2 硫酸銨補料方式對2-KGA發酵的影響Fig.2 Effect of（NH4）2SO4feeding modes on the production of 2-KGA

2.3 不同溶氧水平對發酵的影響

對于好氧發酵生產代謝產物來說，溶氧（Dissolved oxygen，DO）值的控制直接關系著細胞的生長和代謝產物的形成[11-12]。

在研究了葡萄糖和硫酸銨補料策略之后，考察了在最優補料策略下，不同DO濃度對2-KGA合成的影響。

由圖3知，當DO值分別為20%、30%和40%時，隨著其值的提升，細胞生物量逐漸增加，40%時達最大為8.11 g/L；當DO值50%時，細胞生物量反而減少。再綜合2-KGA的產量、得率和產率指標，溶氧為40%時最優，其值分別達到268.5 g/L、1.04 g/g和 6.10 g/L/h。

綜上可知，發酵生產2-KGA是需氧型，DO值的控制要適宜，不是越高越好。可能因為，氧的過高容易產生含氧自由基破壞細胞組分，從而嚴重影響菌體的生長代謝[13]。

圖3 溶氧水平對2-KGA發酵的影響Fig.3 Effect of dissolved oxygen levels on the production of 2-KGA

2.4 30 L發酵罐上FMME043發酵生產2-KGA

在最優葡萄糖和硫酸銨補加策略下維持溶氧為40%，菌株FMME043發酵生產2-KGA的過程曲線表明，2-KGA發酵生產屬于部分生長偶聯型。如圖4所示，1）菌體生物量：0～4 h為菌體的適應階段為延滯期，之后菌體快速生長為對數生長期，32 h菌體生長減慢為穩定期，在36 h菌體干重達到最大值為8.41 g/L。2）底物葡萄糖：前期0～12 h葡萄糖的量下降很少，12 h之后葡萄糖的量迅速降低，28 h耗糖速率減慢，至發酵結束糖耗盡。3）產物2-KGA：0～12 h產物生成較少，12 h之后進入快速生成產物時期，28 h后產物的生成速度減慢，至發酵結束44 h，2-KGA產量為268.5 g/L，糖酸轉化率為1.04 g/g。與在30 L發酵罐上優化前[2]相比，2-KGA的產量、產率和生產強度分別提高了58.4%，11.6%和72.8%。與其他生產2-酮基-D-葡萄糖酸菌株相比，FMME043產量和轉化率最高，對今后的擴大化生產也具有重要的指導意義（見表1）。

圖4 30 L發酵罐上Serratia sp.FMME043發酵產2-KGA的過程曲線Fig.4 Time curves of 2-KGA fermentation by Serratia sp.FMME043 in a 30 L fermentor

表1 高產2-KGA菌株及其產量Table 1 Strains for high 2-KGA production

3 結 語

1）在30 L發酵罐上優化確定了發酵生產2-KGA的最優補加策略及溶氧條件：當初糖濃度由100 g/L降至15～25 g/L，采用五次定量補料方式，使整個發酵過程中葡萄糖濃度低于7%；硫酸銨采用間歇定量補料，16 h補加64 g，22 h補加80 g，28 h補加96 g；溶氧控制在40%。

2）在最優條件下，菌體生長延滯期為4 h，36 h菌體干重達到最大值為8.41 g/L，發酵44 h時，2-KGA產量達到268.5 g/L，產率達到1.04 g/g。

3）通過對溶氧、葡萄糖和硫酸銨等發酵條件和培養基進行優化控制，提升了發酵效價，為今后的2-KGA工業化生產奠定了基礎。