響應面優化汽化過氧化氫殺滅PET瓶內表面枯草芽孢桿菌工藝

楚莉沙，黃莉莉，汪良峰，崔政偉*，劉 波，楊亞軍

（1.江南大學 江蘇省食品先進制造裝備技術重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江蘇新美星包裝機械有限公司，江蘇 張家港 215618）

聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）是目前食品包裝領域最常用的一種材料，特別是在飲料灌裝方面，大多數的飲料瓶是PET材質。在無菌灌裝系統中，食品與包裝材料通常是分開進行滅菌[1]。現階段用于PET飲料瓶的滅菌方法主要有：物理法、化學法及兩者結合3種[2-6]。但是這些方法并不都能高效地殺滅PET瓶表面的微生物。因此，找到一種快速、無殘留的滅菌方式對PET瓶進行滅菌是保證產品質量和提高生產效率所必需的。

過氧化氫具有強氧化性，可形成具有強氧化能力的自由羥基以及活性衍生物，自由羥基和活性衍生物通過破壞微生物的外層保護結構以及內部DNA而起到殺菌的作用[7]。作為一種綠色環保殺菌劑，過氧化氫也越來越多地受到人們的重視。近年來，隨著汽化過氧化氫技術的不斷發展，汽化過氧化氫滅菌法也成了國外各國藥典及滅菌技術規范所推崇的方法，并被廣泛用于醫療衛生、生物制藥和實驗室研究等多種領域[7-9]。同時，就使用過氧化氫滅菌而言，人們也在尋找一種高效、潔凈、成本低廉的滅菌工藝，特別是在環境保護和食品領域。

現階段，國外對于低濃度汽化過氧化氫殺滅枯草芽孢桿菌的研究[2，10]比較多，汽化過氧化氫用于食品包裝方面也有比較成熟的技術[11-12]，但國內的相關報道較少[13-14]。為此，本實驗以PET瓶坯為模型，在單因素試驗的基礎上，觀察汽化過氧化氫對PET瓶坯內表面上枯草芽孢桿菌的殺菌效果，并利用響應面分析法對制備汽化過氧化氫的操作工況（H2O2溶液流量、滅菌時間和滅菌溫度）進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（CMCC（B）63501），江南大學食品學院實驗室保存；氯化鈉、無水乙醇、30%過氧化氫，均為分析純（國藥集團）；營養肉湯（國藥集團）、平板計數瓊脂培養基（國藥集團），均購于學校設備管理處。

1.2 儀器與設備

汽化過氧化氫發生器，江蘇新美星包裝機械股份有限公司；XFS-280M手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋，浙江新豐醫療器械有限公司；SJ-CJ-2FD型雙人單面潔凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；SPX-200生化培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；Lab dance S25小舞靈旋渦混勻器，上海微川精密儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌的培養[15-16]

1）活化：將保存的枯草芽孢桿菌菌種在平板計數瓊脂培養基上進行劃線，于36℃的培養箱中培養24 h。

2）培養：將活化后的枯草芽孢桿菌挑取兩環接種到裝有100 mL營養肉湯（經滅菌）的250 mL錐形瓶中于36℃的培養箱中培養24 h。

3）確定菌液濃度：先取初始菌液10 mL于90 mL無菌蒸餾水中，然后采用梯度稀釋的方法對培養好的種子液進行稀釋，取稀釋度為10-4、10-5、10-63種菌懸液1 mL滴入已標記好的培養皿中，倒入冷卻至45～47℃的平板計數瓊脂培養基，輕輕搖勻，室溫放置15 min左右，待培養基充分凝固后，將接種好的平板倒置，即皿蓋朝下放置，放于36℃的培養箱中恒溫培養24 h。

將培養好的9只平板計數瓊脂培養基從培養箱中取出，10-4、10-5、10-63個濃度之間的倍數大概呈10倍，分別計數每個濃度梯度平板上的菌落數，取3個平板的平均值為該濃度下1 mL菌懸液的菌落數。根據公式

1.3.2 染菌瓶坯制備 試驗用瓶坯為PET材質，內徑約為15 mm，深88 mm，外形尺寸如圖1所示。

圖1 試驗用PET瓶尺寸Fig.1 Size of PET bottle for testing

將培養好的枯草芽孢桿菌菌液0.2 mL滴加到無菌瓶坯中，用旋渦混勻器混勻使得瓶坯內表面均勻的沾有細菌懸液。

1.3.3 汽化過氧化氫制備流程圖2為制備汽化過氧化氫的流程圖。30%過氧化氫溶液和壓縮空氣（約0.5 MP）同時單獨的輸送到加熱器中，兩者在加熱器中混合并加熱生成汽化過氧化氫。過氧化氫溶液流量和壓縮空氣流量分別通過液體流量計與控制器和氣體流量計與控制器進行控制，加熱器加熱溫度通過PLC控制器進行控制，汽化過氧化氫溫度通過電阻式溫度傳感器測量。

圖2 汽化過氧化氫制備流程Fig.2 Process flow diagram for preparation of hydrogen peroxide vapour

試驗用過氧化氫溶液和壓縮空氣混合加熱器圖如圖3所示。

圖3 過氧化氫溶液和壓縮空氣混合加熱器Fig.3 Mixer and heater for hydrogen peroxide and compressed air

1.3.4 殺菌效果測定試驗在無菌通風櫥中進行。試驗前將染菌瓶坯預熱到50℃。實驗時，固定壓縮空氣流量為150 L/min（5 bar），過氧化氫溶液流量、滅菌溫度和滅菌時間均可調。將生成的汽化過氧化氫直接通入到染菌瓶坯瓶口，滅菌一定時間（2、4、7、10 s）后，用50℃熱風將殘留在瓶坯內壁的過氧化氫吹干，加入1.8 mL無菌蒸餾水到瓶坯中，不斷用混勻器混勻，充分洗脫后，以傾注法對殘留菌進行回收計數。同時設置陰陽性對照。試驗重復3次，計算平均滅活細菌的對數值。

1.3.5 汽化過氧化氫殺滅PET瓶坯內表面枯草芽孢桿菌的單因素試驗

1）H2O2溶液流量的確定。汽化過氧化氫的流量對殺菌起著至關重要的作用[17-18]。試驗固定滅菌時間為7 s，滅菌溫度分別為120、140、160℃的情況下，設置汽化過氧化氫發生器的過氧化氫溶液流量分別為 8、10、13、16 mL/min。 測定不同過氧化氫溶液流量對PET瓶內表面枯草芽孢桿菌的殺菌效果。

表1 30%H2O2流量單位換算Table 1 Unit conversion of 30% hydrogen peroxide flowrate

2）滅菌溫度的確定。滅菌溫度的選定對殺菌效果有一定的影響[12]。溫度過低會導致過氧化氫汽化不完全，導致原料的浪費以及對后處理帶來困難，溫度過高則會導致過氧化氫分解，達不到殺菌效果。試驗前對設備進行預處理發現，當滅菌溫度設為100℃時，過氧化氫溶液會出現汽化不完全的情況，瓶坯內壁生成的凝結霧滴比較大，殺菌效果比較差，可能是因為羥基具有親水性，生成的霧滴將羥基分子包裹在中心，大大降低了與細菌的接觸，使得殺菌效果變弱。因此，根據預處理結果以及國內外的研究[19-21]，考到過氧化氫溶液的沸點和設備的溫度設定情況，選擇滅菌溫度為120、140℃和160℃進行試驗。

固定滅菌時間為7 s，H2O2溶液流量分別為8、10、13、16 mL/min的情況下，設置汽化過氧化氫發生器的滅菌溫度分別為120、140、160℃，測定不同滅菌溫度對PET瓶內表面枯草芽孢桿菌的殺菌效果。

3）滅菌時間的確定。滅菌時間是影響殺菌效率的重要因素，并且會影響生產效率。試驗固定滅菌溫度為140℃，H2O2溶液流量分別為10、13、16 mL/min的情況下，考慮到工業生產中對滅菌效率的要求，設定滅菌時間分別為 2、4、7、10 s。 測定不同滅菌時間對PET瓶內表面枯草芽孢桿菌的殺菌效果。

1.3.6 響應面分析法優化滅菌工況根據Box-Benhnken試驗設計原理[22]，在單因素的基礎上，以殺菌對數值為響應值，選取H2O2溶液流量、滅菌溫度和滅菌時間3個因素，設計三因素三水平試驗，試驗因素及設計如表2所示。

表2 汽化過氧化氫殺菌響應面因素水平Table 2 Response surface level of hydrogen peroxide vapour sterilization

試驗以3次所得滅菌對數值的平均值為響應值，共設有17個試驗點，其中12個為析因實驗，5個為中心實驗，用以估計誤差。

1.3.7 數據統計與分析運用OriginPro 9軟件對單因素試驗數據進行統計分析及響應面作圖，采用Design Expert 8.0軟件設計Box-Benhnken中心組合試驗，建立回歸模型并對其進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 H2O2溶液流量對滅菌效果的影響由圖4可知，在滅菌溫度不變的情況下，隨過氧化氫溶液流量的增加，生成的汽化過氧化氫對枯草芽孢桿菌的效果逐漸增強。考慮到PET瓶對殺菌效果的要求，選擇過氧化氫溶液流量在13 mL/min左右比較適宜。

圖4 過氧化氫溶液流量對殺菌效果的影響Fig.4 Effect of hydrogen peroxide flowlate on sterilization

2.1.2 滅菌溫度對滅菌效果的影響由圖5可知，在H2O2溶液流量不變的情況下，隨滅菌溫度的升高，滅菌效果逐漸減弱，這可能是因為隨溫度的升高，加熱過程中過氧化氫分解逐漸加劇，導致生成的羥基分子變少，因而對滅菌效果產生了一定的影響。

圖5 滅菌溫度對殺菌效果的影響Fig.5 Effect of temperature on sterilization

2.1.3 滅菌時間對滅菌效果的影響由圖6可知，在H2O2溶液流量不變的情況下，隨滅菌時間的延長，殺菌效果逐漸增強。綜合考慮PET瓶對殺菌效果以及工業生產對滅菌效率的要求，選擇滅菌時間為7 s左右比較適宜。

圖6 滅菌時間對殺菌效果的影響Fig.6 Effect of treatment time on sterilization

2.2 響應面分析法優化殺菌工藝

2.2.1 響應面實驗設計與分析結果采用Design Expert8.0軟件對表3中的試驗結果進行多元回歸擬合，得到回歸方程為

表3 響應面試驗設計及殺菌結果Table 3 Experimental design and sterilization results for RAS

2.2.2 回歸模型顯著性及響應面分析由表4可得，經方差分析[23]后，該回歸方程的P值 ＜0.05，表明模型比較顯著，失擬項的P值為0.079 4＞0.05（不顯著），說明模型擬合得很好。相關系數R2=1.74/1.80=0.966 7，說明回歸方程與實際數據點擬合良好，能很好地反映出H2O2溶液流量、滅菌溫度和滅菌時間對滅菌效果（殺菌對數值）的影響。同時可得，H2O2溶液流量和滅菌時間一次項對殺菌對數值的影響非常顯著，滅菌溫度的一次項比較顯著，滅菌時間的二次項對殺菌對數值的影響比較顯著，而H2O2溶液流量和滅菌溫度的二次項均不顯著，交互項對殺菌對數值的影響均不顯著。所以，試驗各因素對響應值的影響并不是簡單的線性關系。各因素對滅菌效果的影響大小順序為：滅菌時間＞H2O2溶液流量＞滅菌溫度。

對回歸模型進行分析得出，汽化過氧化氫殺滅枯草芽孢桿菌的最佳工藝條件為：過氧化氫（液態）流量14.13 mL/min，滅菌時間9.33 s，滅菌溫度120℃，此條件下殺菌對數值預測為5.464 07 log?？紤]到試驗操作時的方便，將最優工藝條件修正為過氧化氫溶液流量14 mL/min，滅菌時間9 s，滅菌溫度120℃，在此條件下重復3次試驗，測得的殺菌對數值的平均值是5.40 log，與理論預測值接近，說明此回歸模型預測可靠，能夠很好地反映出試驗各因素對滅菌效果（殺菌對數值）的影響。

運用OriginPro軟件作出各試驗因素對響應值交互影響的等高線與響應面圖（圖7）。從圖7可以清楚地看出，過氧化氫溶液流量、滅菌時間和滅菌溫度兩兩之間交互作用的響應曲面圖均比較平緩，說明各交互作用對殺菌效果的影響并不顯著。

表4 回歸分析試驗結果Table 4 Results of extraction regression analysis

圖7 試驗各因素對殺菌效果的交互影響響應面圖Fig.7 Interaction effect of H2O2flow，sterilizing time and sterilizing temperature on sterilization

3 結 語

在單因素實驗的基礎上，本實驗利用響應曲面法對汽化過氧化氫殺滅枯草芽孢桿菌的工藝參數進行優化分析。利用Design Expert軟件建立了三元二次回歸模型，方差分析得到，各因素對滅菌效果的影響大小順序為：滅菌時間>H2O2溶液流量>滅菌溫度。H2O2流量和滅菌時間一次項X1和X2對殺菌對數值（滅菌效果）的影響非常顯著，滅菌溫度一次項X3比較顯著，滅菌時間二次項X22對殺菌對數值（滅菌效果）的影響比較顯著，而H2O2流量和滅菌溫度二次項X12和X12均不顯著，交互項對殺菌效果的影響均不顯著。對回歸模型進行分析，得到汽化過氧化氫殺滅PET瓶內表面枯草芽孢桿菌的最佳工藝條件為：過氧化氫溶液流量14 mL/min，滅菌時間9 s，滅菌溫度120℃，在此條件下試驗得出，汽化過氧化氫對枯草芽孢桿菌的殺菌對數值可達5.40 log，說明建立的回歸模型可靠，能很好地預測出H2O2流量、滅菌時間和滅菌溫度與滅菌效果（殺菌對數值）之間的關系。