20-羥二十烷四烯酸對人胎盤絨毛膜滋養細胞生物學行為的影響

盧帥軍 朱長玲 喻瑩 王衛華

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠婦女常見的多系統紊亂綜合征之一。隨著國內二胎政策的開放，高齡產婦增加，PE發生率呈上升趨勢[1]。目前關于PE的發病機制尚不清楚，但普遍認為其病理學特征是子宮螺旋動脈重塑障礙[2]。重塑中任何環節異常，都可能引發子癇前期、胎兒生長受限等。本課題組前期研究已證實，20-羥二十烷四烯酸（20-HETE）作為參與重塑過程及血管維護的多個信號轉導系統的上游調控因子，若其代謝異常，相關信號則不能準確轉導，會導致螺旋動脈重塑障礙和血管功能紊亂，從而引發子癇前期[3]。本研究通過體外培養人胎盤絨毛膜滋養細胞并追蹤20-HETE及其抑制劑HET0016對其基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）濃度及mRNA表達的影響，以探討相關機制。

1 材料和方法

1.1 材料 人胎盤絨毛膜滋養細胞購自美國Sciencell公司。20-HETE、HET0016購自美國Cayman公司。human MMP-9 Quantikine elisa Kit、human NGAL Quantikine elisa Kit購自美國R&D公司。RNA提取試劑盒（上海久盛醫療用品有限公司），反轉錄試劑盒（日本Takara公司），實時熒光定量試劑盒（美國Promega公司），化學發光凝膠攝像分析系統（法國ChemilmagerTMXRS），PCR擴增儀（美國ABI公司）。DNA ladder marker、MMP-9及NGAL引物由上海生物工程公司合成。

1.2 最佳藥物濃度的選擇及實驗分組 人胎盤絨毛膜滋養細胞為貼壁生長方式，采用常規方法進行細胞復蘇、傳代、凍存等[3]。（1）20-HETE 細胞培養液配置：采用濃度梯度法，用培養基稀釋100μg/ml的20-HETE溶液，使 20-HETE 濃度依次為 0、5、10、20、40ng/ml。將不同濃度的20-HETE培養基加入生長狀態良好、對數生長期的細胞中，進行藥物最佳作用濃度及時間的測定。（2）HET0016細胞培養液配置：按說明書要求，用二甲基亞砜溶解HET0016粉末，溶解后濃度為10mg/ml；采用濃度梯度法，用培養基稀釋10mg/ml的HET0016溶液，使 HET0016 終濃度依次為 0、5、10、20、40μg/ml。將不同濃度HET0016培養基加入生長狀態良好、對數生長期的細胞中，進行藥物最佳作用濃度及時間的測定。（3）采用噻唑藍（MTT）法檢測細胞生長狀況，篩選出10ng/ml 20-HETE對人胎盤絨毛膜滋養細胞干預48h的增殖影響最明顯，10μg/ml HET0016對人胎盤絨毛膜滋養細胞干預48h的增殖最明顯[3]。（4）按上述結果，將常規培養細胞設為正常對照組，相應二甲基亞砜濃度設為藥物介質組，10ng/ml 20-HETE設為20-HETE組，10μg/ml HET0016設為HET0016組。

1.3 細胞培養 收集對數生長期人胎盤絨毛膜滋養細胞，按實驗分組要求，用已配好的相應藥物最佳濃度培養液調整細胞懸液密度1×105/ml，于24孔板內加入1ml/孔細胞懸液，每組設6個復孔；置于5%CO2、37℃孵箱內培養48h。收集每孔細胞懸液以備ELISA檢測。剩下的每孔底物細胞用PBS漂洗3次，去凈PBS，以備Trizol法提取細胞總RNA。

1.4 人胎盤絨毛膜滋養細胞MMP-9、NGAL濃度的檢測 采用ELISA法。將上述實驗過程中收集的人胎盤絨毛膜滋養細胞懸液在常溫下低速離心，收集上清液。每組設6個復孔，參照ELISA試劑盒說明書進行操作。使用MMP-9和NGAL試劑盒提供的標準品與樣本平行檢測，再通過Excel軟件生成標準曲線及方程，計算各組樣本MMP-9、NGAL濃度。

1.5 人胎盤絨毛膜滋養細胞MMP-9、NGAL mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法。每孔加入Trizol試劑500μl，吹打3～5min使細胞脫落，將細胞懸液移入不含RNAse的無菌EP管中，室溫靜置5min使其充分裂解；加入氯仿 100μl，劇烈震蕩 30s，室溫靜置 5min，4℃12 000g離心15min，將上清液轉移至新的EP管中；加入等體積異丙醇，震蕩10s，室溫靜置10min，4℃12 000g離心10min，棄上清液；加入冰凍的75%乙醇1ml，渦旋10s，充分洗滌RNA沉淀，4℃ 7 500g離心5min；小心吸棄上清液后，在超凈工作臺內敞開管蓋，室溫下風干8min，加入30μl滅菌DEPC水溶解沉淀，并分裝于0.2ml離心管中，留10μl進行RNA濃度、純度和完整性測定；其余提取mRNA逆轉錄成cDNA后擴增，按說明書進行操作。在Primer Bank檢索人MMP-9和NGAL基因全序列，用primer 5.0軟件設計引物，并在基因庫內檢索確認，見表1。1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，上凝膠攝像分析系統分析（以GAPDH擴增片段為密度標準品對各組進行光密度掃描分析），計算各組MMP-9、NGAL mRNA相對表達量。

表1 MMP-9、NGAL和GAPDH引物序列及相關參數

1.6 統計學處理 應用GraphPad Prism7統計軟件，計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 20-HETE及HET0016對人胎盤絨毛膜滋養細胞MMP-9、NGAL濃度的影響 與正常對照組比較，藥物介質組人胎盤絨毛膜滋養細胞MMP-9、NGAL濃度差異均無統計學意義（均P＞0.05），20-HETE組人胎盤絨毛膜滋養細胞MMP-9、NGAL濃度均明顯降低（均P＜0.05），HET0016組人胎盤絨毛膜滋養細胞 MMP-9、NGAL濃度均明顯升高（均P＜0.05），見表2。

2.2 20-HETE及HET0016對人胎盤絨毛膜滋養細胞MMP-9、NGAL mRNA相對表達量的影響 與正常對照組比較，藥物介質組人胎盤絨毛膜滋養細胞MMP-9、NGAL mRNA相對表達量差異均無統計學意義（均P＞0.05），20-HETE組人胎盤絨毛膜滋養細胞MMP-9、NGAL mRNA相對表達量均明顯降低（均P＜0.05），HET0016組人胎盤絨毛膜滋養細胞MMP-9、NGAL mRNA相對表達量均明顯升高（均P＜0.05），見表3和圖1。

表2 20-HETE及HET0016對人胎盤絨毛膜滋養細胞MMP-9、NGAL 濃度的影響（ng/ml）

表3 20-HETE及HET0016對人胎盤絨毛膜滋養細胞MMP-9、NGAL mRNA相對表達量的影響

圖1 人胎盤絨毛膜滋養細胞MMP-9、NGAL mRNA表達的電泳圖（a：正常對照組；b：藥物介質組；c：HET0016組；d：20-HETE 組）

3 討論

在妊娠初期，絨毛膜滋養細胞侵襲螺旋動脈管，與血管內皮細胞、平滑肌細胞相互作用而介導其凋亡，同時分泌MMP降解螺旋動脈管壁的彈性基質，分泌無定型類纖維素樣物質取代細胞外基質，形成絨毛外滋養細胞及纖維素樣物質，從而導致螺旋動脈重塑[4]。重塑中任何環節異常都可能導致重塑不全，引起一系列妊娠并發癥。MMP是參與基質降解的關鍵分子，因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名，切除前肽氨基末端轉化為活性酶[5]。MMP-9是一種鋅依賴性蛋白酶，參與炎癥、組織重塑、基質結合生長因子和細胞因子的激活等[6]。妊娠期母體MMP-9濃度為非妊娠期的10余倍[7]。NGAL是一種公認的抑菌功能蛋白，為脂多糖家族的一員，首次在中性粒細胞中發現。在正常妊娠過程中，NGAL濃度升高可促進MMP-9濃度的變化[8]。在妊娠早期胎盤形成過程中，MMP-9與NGAL平衡紊亂是PE患者細胞外基質和螺旋小動脈細胞滋養細胞侵襲異常的原因之一[8]。

20-HETE是細胞色素-P450家族成員4A和4F介導的花生四烯酸代謝產物，主要通過調節血管張力、腎臟水鈉平衡等參與血壓、血糖的相關作用機制，目前作為對高血壓、高血糖的潛在治療藥物靶點，受到廣泛關注[9]。本課題組前期已證實，20-HETE可促進人絨毛膜滋養細胞和子宮血管平滑肌細胞的增殖，抑制人絨毛膜滋養細胞的浸潤能力（遷移、浸潤作用）[3]。20-HETE作為一種血管收縮劑和促尿鈉排泄類花生酸，既是維持生理條件下穩態平衡的重要物質，又是很多疾病發生、發展中的關鍵因素[10]。

本研究結果證實在體外培養過程中，20-HETE可抑制人胎盤絨毛膜滋養細胞MMP-9與NGAL濃度及表達，而其抑制劑HET0016起促進作用。多項研究表明，MMP-9對維持人類正常妊娠具有重要作用，其在胎盤組織及孕婦血清中的水平隨著妊娠進展而不斷升高，而其表達紊亂常與不良妊娠事件有關，如PE患者胎盤、血清中MMP-9表達明顯低于正常同期孕婦[11-12]。另一方面，體外實驗表明NGAL可通過激活MMP-9前體，結合成NGAL/MMP-9二聚體，促進MMP-9生物學功能的正常發揮[13]。綜合上述研究，可以發現NGAL、MMP-9以及兩者形成的復合物相互協作與彼此平衡，對保證絨毛膜滋養細胞的侵襲功能非常重要，可能是螺旋動脈正常重塑的相關機制之一。因此，NGAL與MMP-9之間平衡關系的打破，可能引起絨毛膜外滋養細胞消化螺旋動脈基質失敗，進而引起螺旋動脈重塑障礙，成為導致PE的一個重要原因。但目前對PE患者胎盤中NGAL及MMP-9異常表達的機制尚未清楚。

已有文獻表明，20-HETE是血管內皮細胞、平滑肌細胞等細胞內多個信號轉導系統（HIF-1α、P13K/AKT/FOSL1等）的上游調控因子或第二、第三信使，參與細胞增殖、分化、遷移等調控，是相關功能調節的關鍵因子[14]。同樣，NGAL可通過HIF-1α和PI3K/AKT途徑來調節血管內皮生長因子和FAK磷酸化，協同MMP-9參與細胞生長、黏附等[15-16]。因此，20-HETE可能通過下調相關信號通路，從而抑制滋養細胞中NGAL的表達，進而引起MMP-9表達的下降。本研究首次證實20-HETE對人胎盤絨毛膜滋養細胞MMP-9和NGAL濃度及表達的抑制作用，這為探討螺旋動脈重塑及相關妊娠并發癥提供新的依據。