消癌平對伊馬替尼在大鼠體內外代謝的影響

黃曦 章利亞 鄭宇紅 夏迎春 黃笑夏

通關藤莖中含有以通關藤苷元甲、通關藤苷元乙、通關藤苷元丙、通關藤素為代表的4類C21甾體苷，具有抗腫瘤活性[1]。消癌平注射液是從通關藤的干燥藤莖中提煉且精制而成的中藥抗腫瘤注射劑，為單方制劑，自上市以來，廣泛用于各種惡性腫瘤的治療，如肺癌、肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、胃癌、多發性骨髓瘤、急性髓細胞白血病等[2-8]。目前，臨床上中藥注射劑與其他藥物聯合使用的現象非常普遍。然而，市面上許多中藥注射劑說明書對藥物相互作用的描述過于簡單、模糊，甚至缺乏[9]。細胞色素P450酶系是多數藥物的主要代謝酶，由此引發的潛在藥物相互作用已得到廣泛重視。甲磺酸伊馬替尼是治療慢性期、急變期或加速期慢性髓性白血病和復發或轉移性胃腸間質瘤的一線用藥，在體內主要經肝微粒體細胞色素P450中的CYP3A4代謝，而CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6和CYP2C19等代謝酶對伊馬替尼的代謝影響較小[10]。相關文獻報道，消癌平注射液能夠抑制CYP3A4的活性，但未見其對伊馬替尼代謝影響的相關報道。本研究先建立同時檢測大鼠血漿中伊馬替尼及N-去甲基伊馬替尼濃度的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS），再觀察消癌平注射液在體內外對伊馬替尼藥代動力學的影響，為其藥物相互作用的研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性健康SD大鼠16只，體質量（250±50）g，由溫州醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2015-0009。

1.2 主要試劑 甲磺酸伊馬替尼（規格100mg，批號S102606，美國Selleck Chemicals LLC公司）；N-去甲基伊馬替尼對照品（規格10mg，批號241902，美國Sigma公司）；卡馬西平對照品（規格50mg，批號0142-9503，中國藥品生物制品檢定所）；消癌平注射液（規格20ml，批號201511061，中國南京圣和藥業有限公司）；人和大鼠肝微粒體（本實驗室自制）；還原性輔酶Ⅱ（NADPH，規格1g，批號N041939-1G，瑞士羅氏公司）。

1.3 主要儀器 ACQUITY H-Class超高效液相色譜儀、Masslynx 4.1色譜工作站和XEVO TQD三重四級桿質譜儀（美國 Waters公司）；TGL-16G高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；Milli-Q純水機（美國Millipore公司）；QL-866渦旋混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；FA2004電子分析天平（上海方瑞儀器有限公司）；DKZ-450B電熱恒溫振蕩水槽（上海森信實驗儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column（2.1×50mm，1.7μm，particle size，Waters Corp）；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫：0～0.5min，40%→85%乙腈，0.5～1.3min，85%乙腈，1.3～1.5min，85%→40%乙腈，1.5～2.5min，40%乙腈；流速：0.4ml/min，柱溫40℃

1.4.2 質譜條件 電噴霧離子化源，正離子檢測模式。定量分析的離子反應分別為伊馬替尼m/z 494.3/394.2，N-去甲基伊馬替尼m/z 480.2/394.2，內標卡馬西平m/z 237.1/194.2。毛細管電壓2kV；伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼、卡馬西平的錐孔電壓分別為55、40、40V，碰撞電壓分別為30、30、20V；離子源溫度150℃；去溶劑化溫度500℃；本儀器用氮氣作去溶劑化氣體（800L/h）及錐孔氣體（50L/h）。

1.4.3 體外試驗 （1）肝微粒體孵育體系：分別將2μl消癌平注射液和2μl消癌平注射液10倍稀釋液（對照組不加消癌平注射液），加入含0.024 7mg/ml伊馬替尼溶液和相應濃度的微粒體孵育體系（0.5mg/ml鼠肝微粒體和0.632 5mg/ml人肝微粒體），200μl孵育體系見表1，每個濃度平行2管。將孵育體系置于37°C水浴恒溫振蕩器中預孵育5min，加入1mM的NADPH啟動反應。孵育30min后立即冷卻到-80°C終止反應。（2）血漿樣品處理：反應終止后，加入400μl乙腈溶劑沉淀蛋白，再加入內標1μg/ml卡馬西平甲醇溶液20μl，渦旋混勻2min，13 000r/min 離心 10min，取 100μl上清液與 100μl超純水1∶1稀釋混勻，2μl稀釋液進樣檢測。

表1 肝微粒體孵育體系

1.4.4 體內試驗 （1）給藥方法與樣品采集：將16只SD大鼠隨機分為兩組，即對照組和給藥組，每組8只。其中給藥組大鼠按7.5ml/kg腹腔注射消癌平注射液，1次/d，連續10 d。給藥組最后一次給予消癌平注射液后，兩組大鼠單次灌胃伊馬替尼（30mg/kg），分別于灌胃后的 0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24h 取 大 鼠 尾 靜 脈 血 樣0.5ml于1.5ml EP管中，13 000r/min離心10min，分離的血漿于-80℃冰箱保存待測。（2）血漿樣品處理：樣品解凍后，取100μl于EP管中，加入乙腈溶劑200μl來沉淀蛋白，再加入1μg/ml卡馬西平甲醇溶液20μl，并渦旋混勻2min，充分混勻后13 000r/min離心10min，取上清液100μl與超純水100μl（1∶1）稀釋混勻，2μl稀釋液進樣檢測。

1.5 方法學考察 在正式實驗前，參照體內試驗的血漿樣品處理方法進行處理，并作質譜分析，記錄伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼和內標峰面積，以伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼與內標的比值為縱坐標，以伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼為橫坐標繪制標準曲線，得出兩者的線性回歸方程。伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼的濃度分別為 50、1 000、10 000 和 20、100、1 000ng/ml，取每種濃度樣品6份，參照體內試驗的血漿樣品處理方法進行處理；同一天測定日內精密度，連續3d作同樣操作，以測定日間精密度。取上述每種濃度樣品6份處理后檢測，依據標準曲線計算檢測濃度，以檢測的峰面積直接與相應濃度的伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼對照品溶液直接進樣所得的峰面積進行比較，計算提取回收率。將已處理空白血漿配制的上述濃度的伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼的標準品溶液峰面積與相應濃度的標準品直接進樣的峰面積比較，計算基質效應。同時考察預處理樣品在室溫、自動進樣器、-20℃放置和反復凍融條件下的穩定性。

1.6 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。應用DAS 3.0軟件對藥動學參數進行分析。

2 結果

2.1 UPLC-MS/MS分析結果 實驗結果表明，內源性雜質峰不干擾測定，伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼與內標及血漿中的內源性物質能得到良好的分離，結果見圖1。伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼的線性回歸方程分別為 y1=0.000 3 x1＋0.036 3（r2=0.999 2）和 y2=0.000 07 x2＋0.000 2（r2=0.999 5），血漿濃度分別在 20～10 000、1～1 000ng/ml時線性關系良好，定量下限分別為20、1ng/ml。伊馬替尼的日間、日內精密度相對標準偏差（RSD）均＜15%，N-去甲基伊馬替尼的日間、日內精密度RSD亦均＜15%。伊馬替尼低、中、高濃度的提取回收率分別為（88.11±7.15）%、（92.61±6.00）%、（87.67±5.08）%，基質效應分別為（86.44±10.29）%、（89.15±7.74）%、（97.06±7.27）%；N-去甲基伊馬替尼低、中、高濃度的提取回收率分別為（87.26±11.16）%、（97.66±5.77）%、（98.89±3.54）%，基質效應分別為（96.08±3.52）%、（101.64±3.25）%、（93.95±4.58）%。伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼分別在室溫放置12h、自動進樣器中放置12h、經歷3次凍融（冷凍與解凍循環）、-20℃放置12d，穩定性良好。該法可用于伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼的血漿測定。

2.2 消癌平在體外對伊馬替尼的作用 以伊馬替尼為底物，消癌平注射液和消癌平注射液10倍稀釋液在大鼠肝微粒體中的抑制作用分別達到了90.83%和50.73%，在人肝微粒體中的抑制作用分別達到了79.44%和28.77%。由此得出，消癌平在大鼠肝微粒體和人肝微粒體中對伊馬替尼均有明顯的抑制作用。

2.3 血藥濃度-時間曲線 兩組大鼠按30mg/kg單劑量灌胃伊馬替尼后，隨著時間的增加，伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼的血藥濃度曲線右移，見圖2-3。

圖1 伊馬替尼及N-去甲基伊馬替尼的UPLC-MS/MS色譜圖（a：空白血漿，b：伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼血漿對照品；c：血漿樣品）

圖2 兩組大鼠血漿伊馬替尼的藥-時曲線

圖3 兩組大鼠血漿N-去甲基伊馬替尼的藥-時曲線

2.4 藥動學參數 伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼藥動學數據經過DAS 3.0軟件處理后，采用非房室模型統計矩計算藥動學參數，結果見表2～3。相比于空白對照組，大鼠按7.5ml/kg連續10d腹腔注射消癌平注射液后，血漿伊馬替尼達峰時間（Tmax）由2.500h延長至5.143h，延后了105.72%；表觀分布容積（Vz/F）由2.682L/kg減少至2.018L/kg，減少了24.76%；AUC增加，峰濃度（Cmax）增大，清除率（CLz/F）減小。相比于空白對照組，大鼠按7.5ml/kg連續10d腹腔注射消癌平注射液后，血漿 N-去甲基伊馬替尼AUC(0-t)由 13 470.171μg/L·h減少至 10 591.962μg/L·h，減少了 21.37%；AUC(0-∞)由13 915.901μg/L·h 減少至 11 231.875μg/L·h，減少了19.29%；Tmax由4.667h延長至5.067h，延后了35.70%；Cmax由1 112.462μg/L減少至889.847μg/L，減少了20.01%；Vz/F由14.723L/kg增加至21.405L/kg，增加了45.38%；CLz/F由2.241L/（h·kg）增加至2.968L/（h·kg），增加了32.44%；半衰期延長，平均停留時間延長。由此得出，消癌平注射液對伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼的藥代動力學有一定的影響。

表2 兩組大鼠血漿伊馬替尼的藥動學參數

表3 兩組大鼠血漿N-去甲基伊馬替尼的藥動學參數

3 討論

伊馬替尼在體內主要經肝微粒體CYP3A4代謝生成N-去甲基伊馬替尼，它可能與多種藥物產生相互作用，如辛伐他汀、美托洛爾、利福平、環孢菌素、華法林等[10]。相關文獻報道，消癌平注射液能抑制CYP3A4的活性[11]。劉麗雅等[12]利用體外人肝微粒體孵育技術，從藥物代謝方面觀察消癌平注射液對CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和 CYP3A4/5 各亞酶的活性影響，結果表明除CYP2D6外，消癌平注射液對其他亞酶均有明顯的抑制作用。周靜雅[13]將消癌平注射液加入到體外人肝微粒體孵育體系中，探究其對 CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和 CYP3A4 各亞酶的活性影響，實驗結果顯示消癌平對以上5個酶均有抑制作用，且對CYP3A4的半抑制濃度（IC50）為46 000ng/ml；同時進一步開展了消癌平注射液和化療藥物多西他賽大鼠體內藥代動力學實驗，結果顯示消癌平注射液能夠抑制CYP3A4底物多西他賽在大鼠體內的代謝過程。本研究以伊馬替尼為底物，消癌平注射液為抑制劑，消癌平注射液和消癌平注射液10倍稀釋液對伊馬替尼的抑制作用在大鼠肝微粒體中分別達到了90.83%和50.73%，消癌平注射液和消癌平注射液10倍稀釋液對伊馬替尼的抑制作用在人肝微粒體中分別達到了79.44%和28.77%；這說明消癌平注射液對伊馬替尼有明顯的抑制作用。

雖然肝微粒體體外溫孵法對反應體內代謝情況具有一定的價值，但考慮到藥物在體內的代謝過程非常復雜，因此還需要體內實驗作進一步研究。基于體外實驗結果，筆者又進行了消癌平注射液與伊馬替尼在大鼠體內的藥代動力學實驗。在實驗中，筆者建立了UPLCMS/MS，可同時檢測大鼠血漿中伊馬替尼及其活性代謝產物N-去甲基伊馬替尼濃度。相比于高效液相色譜，UPLC-MS/MS具有耗時短、進樣量少、靈敏度高等優點，是一種檢測伊馬替尼及其活性代謝產物N-去甲基伊馬替尼濃度的有效手段。從動物體內實驗結果可知，大鼠腹腔注射消癌平后，血漿伊馬替尼及其活性代謝產物N-去甲基伊馬替尼的藥代動力學參數發生了改變：相比于空白對照組，大鼠按7.5ml/kg連續10d腹腔注射消癌平注射液后，血漿伊馬替尼的Tmax延后了105.72%，Vz/F減少了24.76%；血漿N-去甲基伊馬替尼的AUC(0-t)減少了 21.37%，AUC(0-∞)減少了 19.29%，Tmax延后了 35.70%，Cmax減少了20.01%，Vz/F增加了45.38%，CLz/F增加了32.44%。由此得出，消癌平注射液對伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼的藥動學有一定的影響。

筆者發現，體外實驗中消癌平注射液對伊馬替尼代謝表現出明顯的抑制作用；但在大鼠體內實驗中消癌平注射液對伊馬替尼代謝未表現出明顯的抑制作用，考慮與體內生理環境復雜且影響因素（吸收、分布、排泄等）較多有關。相關研究結果顯示，血漿伊馬替尼濃度與慢性粒細胞白血病[14]、胃腸間質瘤[15]的療效息息相關，而個體間伊馬替尼的CLz/F又有40%的差異[16]，藥物相互作用對伊馬替尼血藥濃度的影響在個體間可能被放大，進而導致治療失敗和不良反應發生。由于消癌平注射液和伊馬替尼均為腫瘤科常用藥物，此實驗結果具有潛在的臨床意義。本實驗為消癌平注射液與伊馬替尼合用的初步結果，且伊馬替尼為單次給藥。由于甲磺酸伊馬替尼臨床常用劑量為400～600mg/d，最大劑量可加至800mg/d，且需要長期給藥，長期聯合用藥的結果可能會產生更大的影響。

總之，本研究在人與大鼠肝微粒體體外孵育藥物的體系中，以伊馬替尼為底物，加入消癌平注射液，結果顯示其在相應微粒體孵育體系中對伊馬替尼的代謝過程有明顯的抑制作用。結合消癌平注射液對伊馬替尼在大鼠體內的藥代動力學的影響，在臨床同時應用消癌平注射液和伊馬替尼時，應密切關注患者的臨床癥狀及伊馬替尼血藥濃度Tmax。