甲氨蝶呤單用和聯(lián)合米非司酮對(duì)假孕家兔輸卵管的影響

韋偉 黃靈繡 宋光輝 李百加 鄒少晗

異位妊娠是一種常見的婦科疾病。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）作為一種抗有絲分裂活性的藥物，在異位妊娠早期保守治療中效果顯著。目前對(duì)MTX的研究一直偏向于異位妊娠保守治療療效和腫瘤化療后對(duì)卵巢、骨髓造血功能的損害上，對(duì)輸卵管影響的研究較少[1]。米非司酮為孕激素受體（progestrone receptor，PR）拮抗劑，主要通過抑制孕激素的作用改變子宮內(nèi)膜容受性以及抑制排卵而達(dá)到抗早孕和避孕的目的。臨床上MTX聯(lián)合米非司酮應(yīng)用于異位妊娠的早期保守治療一直存在爭(zhēng)議，其實(shí)際效果也有待商榷[2]。本研究從輸卵管收縮功能、形態(tài)學(xué)、雌激素受體（estrogen receptor，ER）及PR角度觀察不同劑量MTX單用和聯(lián)合米非司酮對(duì)假孕家兔輸卵管的影響，為MTX治療對(duì)后續(xù)妊娠的潛在影響提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)，并探討米非司酮治療異位妊娠的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雌性日本大耳白兔50只，體重（2.3±0.2）kg，月齡（4±0.3）個(gè)月，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。普通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物條件下飼養(yǎng)，置于室溫25℃，正常的晝夜光照。

1.2 試劑及儀器 人尿促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG）針劑（75IU/支）、人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）針劑（1 000IU/安瓿）購(gòu)自麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠。MTX針劑（100mg/支）購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。米非司酮片（25mg/片）購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司。兔抗人ER及PR單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。自制Lock緩沖液：18g氯化鈉，0.84g氯化鉀，48g氯化鈣，0.3g碳酸氫鈉，2g葡萄糖，用去離子水定容至2 000ml，pH=7.4。張力換能器（規(guī)格：0～10g）、微調(diào)固定器購(gòu)自北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司。MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（規(guī)格：四通道）購(gòu)自南京美易科技有限公司。HSS-1（B）型恒溫浴槽購(gòu)自成都儀器廠。SCM型雙層麥?zhǔn)显∶筚?gòu)自北京牧晨玻璃儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 假孕家兔模型制備及給藥方法 實(shí)驗(yàn)前制作假孕模型[3]，采用隨機(jī)數(shù)字表法將50只家兔分為單用MTX 1mg/kg組、單用MTX 2mg/kg組、MTX 1mg/kg聯(lián)合米非司酮組、MTX 2mg/kg聯(lián)合米非司酮組和對(duì)照組5組，每組10只，于動(dòng)情期肌肉注射HMG 50IU/kg，24h后再肌肉注射HCG 100IU/kg。于致假孕后第4天按照各自劑量一次性肌肉注射MTX；MTX聯(lián)合米非司酮各組另加喂米非司酮片（0.5mg/kg），研碎化水灌胃，早晚各1次，共3d；對(duì)照組僅一次性肌肉注射0.9%氯化鈉注射液2ml。

1.3.2 輸卵管收縮功能檢測(cè) 用藥結(jié)束1周后采用空氣栓塞法處死假孕家兔，立即剖腹。取一側(cè)輸卵管峽部長(zhǎng)約1cm。張力換能器由微調(diào)固定器固定然后連接MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)。輸卵管一端連接張力換能器，一端固定于麥?zhǔn)显∶蟮撞浚尤隠ock緩沖液，從底部通入空氣，浴皿置于37℃恒溫浴槽之中。靜息狀態(tài)下先調(diào)零然后通過MedLab系統(tǒng)觀察輸卵管收縮頻率及幅度變化，時(shí)間為60min。收縮頻率是從收縮記錄圖上找出每次記錄區(qū)間內(nèi)的所有收縮波，單位為次/30min；收縮幅度為每次收縮的最高點(diǎn)與最低點(diǎn)之間的差值，單位為mV。

1.3.3 輸卵管常規(guī)病理檢查 取另一側(cè)輸卵管壺腹部用10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片后HE染色，在光鏡下觀察各組形態(tài)學(xué)變化。

1.3.4 輸卵管壺腹部組織ER、PR表達(dá)檢測(cè) 采用SP免疫組化二步法：切片脫蠟后高壓修復(fù)，滴加過氧化氫甲醇液阻斷，室溫孵育，滴加一抗4℃冰箱過夜；復(fù)溫后滴加二抗，DAB顯色至顯微鏡下出現(xiàn)著色清晰、境界明確的棕黃色陽(yáng)性產(chǎn)物，沖洗后蘇木素復(fù)染，PBS沖洗返藍(lán)；梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。結(jié)果判斷：ER、PR定位于細(xì)胞核，每張切片在200倍光鏡下觀察5個(gè)視野，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)占30%為（＋），占50%以上為（＋＋＋），兩者之間為（＋＋），未見陽(yáng)性細(xì)胞或只有極少數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞為（-），以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。ER、PR表達(dá)陽(yáng)性率=ER、PR表達(dá)（＋＋＋）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況 假孕家兔模型建立成功，無(wú)一只死亡。與對(duì)照組相比，所有假孕家兔在MTX、米非司酮處理后的期間內(nèi)均未觀察到明顯的異常行為，在實(shí)驗(yàn)取材過程中，各組家兔輸卵管大體解剖均未發(fā)現(xiàn)明顯的肉眼改變。

2.2 各組輸卵管收縮功能比較 與對(duì)照組比較，各用藥組輸卵管收縮頻率均增快，收縮幅度均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；單用MTX兩組輸卵管收縮頻率和收縮幅度比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；與單用MTX兩組比較，聯(lián)合用藥兩組輸卵管收縮幅度均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1和圖1。

表1 各組輸卵管收縮功能比較

2.3 各組輸卵管壺腹部組織形態(tài)學(xué)變化 光鏡下可見對(duì)照組輸卵管黏膜纖毛及柱狀上皮完整（圖2a）；單用MTX 1mg/kg組輸卵管黏膜纖毛及間質(zhì)輕度水腫（圖2b）；單用MTX 2mg/kg組輸卵管黏膜水腫，可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2c）；MTX 1mg/kg聯(lián)合米非司酮組輸卵管黏膜纖毛及間質(zhì)水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2d）；MTX 2mg/kg聯(lián)合米非司酮組輸卵管黏膜纖毛及間質(zhì)水腫明顯，炎性細(xì)胞浸及全層，并見少量嗜酸性粒細(xì)胞（圖2e）。

圖1 各組輸卵管收縮圖形，每一個(gè)波為一次收縮活動(dòng)（a：對(duì)照組；b：MTX 1mg/kg 組；c：MTX 1mg/kg 聯(lián)合米非司酮組；d：MTX 2mg/kg組；e：MTX 2mg/kg聯(lián)合米非司酮組；收縮幅度以mV表示，每一格為1.2mV）

圖2 各組輸卵管壺腹部組織形態(tài)學(xué)變化（a：對(duì)照組；b：?jiǎn)斡肕TX 1mg/kg組；c：?jiǎn)斡肕TX 2mg/kg組；d：MTX 1mg/kg聯(lián)合米非司酮組；e：MTX 2mg/kg聯(lián)合米非司酮組；HE 染色，×100）

2.4 各組輸卵管壺腹部組織ER陽(yáng)性表達(dá)率比較MTX 2mg/kg聯(lián)合米非司酮組較對(duì)照組ER陽(yáng)性表達(dá)率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其余各用藥組與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。各用藥組之間ER陽(yáng)性表達(dá)率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表 2和圖 3（插頁(yè)）。

2.5 各組輸卵管壺腹部組織PR陽(yáng)性表達(dá)率比較MTX 2mg/kg聯(lián)合米非司酮組較對(duì)照組PR陽(yáng)性表達(dá)率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其余各用藥組與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。各用藥組之間PR陽(yáng)性表達(dá)率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表 3和圖 4（插頁(yè)）。

表2 各組輸卵管壺腹部組織ER陽(yáng)性表達(dá)率比較（只）

3 討論

輸卵管由外向內(nèi)一共分3層：漿膜層，平滑肌層（外層為縱肌層、內(nèi)層為環(huán)肌層），黏膜層。輸卵管黏膜上皮為單層柱狀上皮，主要包含了纖毛上皮細(xì)胞和無(wú)纖毛上皮細(xì)胞，兩者的比例以及兩種細(xì)胞的高度與雌孕激素水平有關(guān)。雌孕激素及腎上腺素的多重調(diào)節(jié)引起輸卵管內(nèi)層平滑肌蠕動(dòng)以及外層平滑肌縱向運(yùn)動(dòng)，兩者的協(xié)同作用引起黏膜層纖毛上皮細(xì)胞規(guī)律擺動(dòng)，從而起到輸送受精卵的目的[4]。本實(shí)驗(yàn)因沒有理想的異位妊娠動(dòng)物模型，故采用假孕家兔的輸卵管作為研究模型，同時(shí)采用的藥物劑量與臨床治療劑量基本相符，因而也能取得較好的一致性。

表3 各組輸卵管壺腹部組織PR陽(yáng)性表達(dá)率比較（只）

圖3 各組輸卵管壺腹部組織ER陽(yáng)性表達(dá)情況[a：ER陰性表達(dá)（-）；b：ER 陽(yáng)性表達(dá)（+）；c：ER 陽(yáng)性表達(dá)（++）；d：ER 陽(yáng)性表達(dá)（+++）；免疫組化染色，×200]

圖4 各組輸卵管壺腹部組織PR陽(yáng)性表達(dá)情況[a：PR陰性表達(dá)（-）；b：PR 陽(yáng)性表達(dá)（+）；c：PR 陽(yáng)性表達(dá)（++）；d：PR 陽(yáng)性表達(dá)（+++）；免疫組化染色，×200]

MTX為葉酸類似物，通過抑制二氫葉酸還原成四氫葉酸，減少一碳單位形成，從而抑制DNA的合成和細(xì)胞能量代謝。臨床常用于異位妊娠的保守治療和腫瘤的化療。MTX治療對(duì)卵巢及骨髓造血功能的損害已有深入研究，但對(duì)后續(xù)妊娠的潛在影響尤其對(duì)輸卵管的影響研究甚少。有學(xué)者研究認(rèn)為MTX會(huì)導(dǎo)致線粒體溶解，胞質(zhì)空泡形成，纖毛的倒伏斷裂，這在一定程度上可導(dǎo)致不孕不育和異位妊娠[5-6]。低劑量下這種損傷在一定時(shí)間內(nèi)可以部分恢復(fù)，若劑量＞5mg/kg，這種損傷則無(wú)法恢復(fù)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，注射MTX后輸卵管收縮頻率加快，收縮幅度下降，而劑量由1mg/kg增加至2mg/kg后輸卵管收縮活動(dòng)并沒有產(chǎn)生明顯變化。這可能與MTX影響DNA、RNA的合成從而影響蛋白（肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白）的生成；損傷細(xì)胞誘發(fā)前列腺素釋放以及炎癥反應(yīng)促白三烯和前列腺素的合成從而刺激輸卵管收縮頻率而抑制收縮活動(dòng)有關(guān)[8-9]。另外MTX在低劑量（1mg/kg）時(shí)就會(huì)導(dǎo)致黏膜纖毛及間質(zhì)水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，這種改變同MTX的劑量呈相關(guān)性。在觀察MTX對(duì)輸卵管壺腹部組織ER、PR陽(yáng)性表達(dá)的影響時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)MTX 1mg/kg組、MTX 2mg/kg組和MTX 1mg/kg聯(lián)合米非司酮與對(duì)照組ER及PR陽(yáng)性表達(dá)率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與本試驗(yàn)最初的設(shè)想以及其他學(xué)者的研究略有出入，可能與樣本量過少有關(guān)。

米非司酮為PR拮抗劑，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PR和腎上腺素受體，通過拮抗孕激素改變子宮內(nèi)膜容受性和抑制排卵達(dá)到抗早孕及避孕的目的。目前對(duì)米非司酮的研究偏向于抗孕激素治療，如治療子宮腺肌癥、子宮肌瘤等，而對(duì)輸卵管本身的影響研究較少[10]。王莉芬等[11]報(bào)道米非司酮在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制PR的合成，下調(diào)ER含量，在增生期和分泌期輸卵管ER、PR表達(dá)率相對(duì)較高，妊娠期較非妊娠期表達(dá)明顯下降。與子宮內(nèi)膜相比，輸卵管部位ER、PR表達(dá)更低[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)MTX劑量一定的情況下添加米非司酮后較單用MTX輸卵管收縮頻率無(wú)變化，但收縮幅度下降，并且可在組織學(xué)水平加重MTX對(duì)輸卵管組織的損傷。此外與對(duì)照組比較，MTX 2mg/kg聯(lián)合米非司酮組ER、PR陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低，而MTX 1mg/kg聯(lián)合米非司酮組與對(duì)照組ER、PR陽(yáng)性表達(dá)率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此提示MTX達(dá)到一定劑量（2mg/kg）時(shí)，其聯(lián)合米非司酮的確可以下調(diào)ER、PR的表達(dá)。

綜上所述，MTX可以對(duì)輸卵管的活動(dòng)產(chǎn)生一定的抑制作用，并可以對(duì)輸卵管組織學(xué)造成一定損傷，且這種損傷與劑量呈相關(guān)性，而米非司酮可以增強(qiáng)MTX的上述作用。當(dāng)MTX達(dá)到一定劑量時(shí)，其聯(lián)合米非司酮會(huì)對(duì)輸卵管ER、PR的表達(dá)起到抑制作用，在較低劑量（1mg/kg）時(shí)，這種作用不明顯。因而在臨床使用MTX治療異位妊娠或行腫瘤化療時(shí)應(yīng)盡可能減少劑量，因其可能會(huì)增加后續(xù)異位妊娠或不孕癥的發(fā)生概率。米非司酮在治療異位妊娠時(shí)，不但增加了MTX對(duì)輸卵管的損傷及抑制，而且在輸卵管部位抗孕激素、抗早孕的作用弱，增加了內(nèi)出血的風(fēng)險(xiǎn)，因而其輔助治療異位妊娠的理論依據(jù)不夠充分，需慎重使用。