HPLC法測定杏香兔耳風中熊果苷和對苯二酚的含量

楊飛

摘 要：目的：建立杏香兔耳風中熊果苷和對苯二酚含量測定方法。方法：采用HPLC法，以甲醇-0.4%磷酸水為流動相，流速0.65mL/min，等度洗脫，檢測波長為286nm。結果：熊果苷進樣量在0.35μg～3.5μg范圍內呈線性關系（r=1.0000，n=6），平均回收率為99.75%；對苯二酚進樣量在0.025μg～0.25μg范圍內呈線性關系（r=1.0000，n=6），平均回收率為98.04%。結論：建立HPLC法同時測定杏香兔耳風中熊果苷和對苯二酚的含量，為控制藥材質量提供方法。

關鍵詞：杏香兔耳風；熊果苷；對苯二酚；HPLC

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2019）05-0199-02

杏香兔耳風（Ainsliaea fragrans Champ.）為菊科兔耳風屬植物干燥全草，分布于長江流域及南方各省[1]，具有清熱、利濕、涼血、解毒功效，治療感冒咳喘、咽喉痛、腸炎、痢疾、泌尿疾病等癥[2-3]。藥理學研究表明，該屬植物具有抗菌、止血、保肝、細胞毒作用等[4-5]。化學成分主要有酚酸類、黃酮類和萜類等[6]。

杏香兔耳風含量測定的研究報道較多，多以木犀草素、綠原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸[7]等指標成分進行含量測定，尚未見熊果苷或對苯二酚等指標成分進行含量測定報道。本文選擇熊果苷和對苯二酚作為指標成分，采用高效液相色譜法同時測定其含量，為控制藥材質量提供可靠方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-20AT系列高效液相色譜儀（日本島津）：LC-20AT液相色譜輸液泵、CTO-10AS柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器、LC-Solution色譜數據處理系統；KQ-500DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，江蘇）；TGL-16型高速離心機（江蘇金壇市中大儀器廠）；AB135-S型十萬級電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，瑞士）。

1.2 植物與試劑

杏香兔耳風于2013年6月采于貴州貴陽市，由河南大學李昌勤教授鑒定為菊科兔耳風屬植物杏香兔耳風Ainsliaea fragrans Champ。

熊果苷對照品（純度：HPLC≥98%，成都普菲德生物技術有限公司，批號：120715，供含量測定用）；對苯二酚對照品（純度：GC>99%，德國默克股份兩合公司，供含量測定用）；甲醇（色譜純）；水為純凈水（杭州娃哈哈百利食品有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備

精密稱取熊果苷對照品和對苯二酚對照品分別為3.5mg和0.25mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.35mg/mL熊果苷和0.025mg/mL對苯二酚混合對照品儲備液。

1.3.2 供試品溶液的制備

取杏香兔耳風粉末（過70目篩）4.00g，置于100mL錐心瓶中，精密加甲醇（分析純）50mL，超聲（功率300W，頻率40kHz）30min，用甲醇補足減失的重量，即得。

1.3.3 色譜條件[8～9]

色譜柱：PurospherstarRP-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸水（30：70）流速：0.65mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：286nm；進樣量：4μL。熊果苷對照品和對苯二酚對照品及供試品的HPLC圖見圖1。

1.3.4 線性關系的考察

精密吸取2.1項下的熊果苷和對苯二酚混合對照品溶液，按杏香兔耳風色譜條件，分別依次進樣1、2、4、6、8和10μL，記錄各組分峰面積。

1.3.5 精密度實驗

精密吸取2.1項下的熊果苷和對苯二酚混合對照品儲備液4μL注入液相色譜儀，連續進樣6次，測得熊果苷和對苯二酚的峰面積。

1.3.6 穩定性實驗

精密吸取杏香兔耳風樣品5μL，按上述杏香兔耳風供試品溶液方法進樣，分別在0、3、6、9、12和24h依法測定，測得熊果苷和對苯二酚的峰面積。

1.3.7 重復性實驗

精密稱取杏香兔耳風樣品6份，按上述供試品制備方法制成供試品溶液，按上述杏香兔耳風色譜條件進樣5μL，測定熊果苷和對苯二酚的峰面積。

1.3.8 加樣回收率試驗

稱取已知熊果苷和對苯二酚含量的杏香兔耳風粉末（過70目篩）6份，每份為400mg，加入一定量的標準品，按供試品溶液制備項下方法制備溶液，按上述色譜條件進樣5μL，記錄峰面積值。

1.3.9 樣品處理

（1）杏香兔耳風水提醇沉物。取杏香兔耳風粉末約50.00g，置于1000mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水500mL，加熱回流提取2h，抽濾得濾液，將濾渣加蒸餾水400mL，再加熱回流提取1h，將濾液稍濃縮后加95%乙醇使醇含量達到70%，醇沉，上清液濃縮，即得水提醇沉物。

（2）杏香兔耳風乙醇/乙酸乙酯提取物。取杏香兔耳風粉末50.00g，置于1000mL圓底燒瓶中，加入乙醇/乙酸乙酯500mL，加熱回流提取2h，抽濾得濾液，將濾渣再加相應溶劑400mL，再加熱回流提取1h，合并兩次濾液，濃縮，即得相應溶劑的提取物。

（3）杏香兔耳風甲醇提取物。取上述乙酸乙酯第二次加熱回流后的濾渣置于1000mL圓底燒瓶中，加入甲醇500mL，加熱回流提取2h，抽濾得濾液，將濾渣再加甲醇400mL，加熱回流提取1h，合并兩次濾液，濃縮，即得相應溶劑的提取物。

（4）樣品高效液相色譜法。精密稱取浸膏，用甲醇（色譜純）溶解制成供試品溶液，按上述杏香兔耳風色譜條件均進樣4μL，測定熊果苷和對苯二酚的峰面積。

2 結果

2.1 線性關系的考察

以進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標做標準曲線，熊果苷的回歸方程為Y=668115.01X+ 5579.18，r=1.0000，線性范圍：0.35～3.5μg；對苯二酚的回歸方程為Y=1E+06X+143.22，r=1.0000，線性范圍：0.025 ～0.25μg。

2.2 精密度實驗

峰面積結果計算RSD分別為0.30%和0.99%，結果表明儀器的精密度良好。

2.3 穩定性實驗

峰面積結果計算RSD分別為0.78%和1.87%，結果表明供試品中熊果苷和對苯二酚在24h內基本穩定。

2.4 重復性實驗

峰面積結果計算RSD分別為1.31%和2.05%，結果表明本實驗重現性好。

2.5 加樣回收率實驗

記錄峰面積值，由回歸方程計算含量，按下式計算加樣回收率，結果見表1和表2。

回收率%=（測得總量-樣品中含量）/加入對照品量×100%

2.6 樣品含量測定

記錄樣品峰面積值，根據回歸方程算出樣品中熊果苷和對苯二酚含量，最后得出相應的百分含量。結果如表3。

3 討論

分別考察了甲醇-水、甲醇-磷酸水以及不同比例流動相，最終選定效果較好的甲醇-0.4%磷酸水（30：70），分離效果好，峰形對稱，拖尾因子最小。當較小的改變流動相比例時，會使熊果苷和對苯二酚拖尾因子變大。

參考文獻

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].第79卷.北京：科學出版社，1996.

[2] 江蘇新醫學院.中藥大辭典[M].上海：上海人民出版社，1977.

[3] ZHOU YB， HE SZ. Species and distribution of Ainsliaea medicinal plants in Guizhou[J]. China J Chin Mater Med，1998，23（7）：389.

[4] 李桂蘭，芮成.3種杏香兔耳風提取物抑菌活性的研究[J].中國醫藥指南，2010，8（7）：45-47.

[5] 崔雪靖.復方半邊蓮和復方杏香兔耳風保肝活性研究[D].河南大學，2014.

[6] 邢春秀，謝寧，楊念云，等.杏香兔耳風的化學成分[J].江蘇藥學與臨床研究，2006，14（2）：39.

[7] 鄔浩杰，鄒盛勤.HPLC法測定不同產地杏香兔耳風中綠原酸和木犀草素的含量[J].中國藥師，2014，17（6）：929-931.